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第一部分通过权重基因共表达网络(WGCNA)筛选与膀胱癌进展相关的分子标志物
目的：采用权重基因共表达网络分析筛选膀胱癌患者基因表达谱与临床病例数据之间的相关性，鉴定与膀胱癌临床特征相关的基因。
方法：从NCBIGeneExpressionOmnibus(GEO)公共数据库筛选膀胱癌表达谱芯片，同时获取了TCGA数据库膀胱癌组织(TCGA BLCA)RNA二代测序结果。采用R包limma筛选差异表达基因。采用WGCNA构建无尺度共表达网络，将基因划分为不同的模块，采用Pearsons相关性计算不同模块与临床特征之间的相关系数，鉴定出与肿瘤临床特征相关性最高的模块(Clinically most related modules )。根据基因显著性(Gene significance)和模块相关性(Modulemembership，筛选目标模块中的关键基因(hubgenes)。采用非配对T检验(unpairedt-test)检测关键基因在不同临床特征之间的差异，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析关键基因在不同肿瘤分期之间的差异。采用膀胱癌组织芯片来检测关键基因的蛋白水平表达。
结果：以FDR＜0.05和差异倍数(Fold Change)绝对值≥1.2为筛选阈值，总筛选出873个差异基因。将差异基因作为目标基因进行WGCNA分析，差异基因表达分布符合无尺度网络条件(Scale-free network)，共鉴定出6个共表达模块,yellow模块与病理分期(stage)和侵袭性(Invasion)均具有最高的相关性(cor=0.5,p=4e-07；cor=0.53,p=4e-06)，确定yellow模块为临床感兴趣的模块(Clinically interested module)，又称关键模块(Key module)。在关键模块中，总共鉴定了19个网络中心基因，进一步通过生存分析、ROC曲线分析以及膀胱癌组织qPCR验证，最终确定HMGCS2与膀胱癌分期和预后相关的关键基因。进一步，利用膀胱癌组织芯片检测HMGCS2蛋白的表达，确定HMGCS2在膀胱癌组织中明显低表达，并且随肿瘤分期越高而表达水平下降。
结论：HMGCS2可能作为鉴别膀胱癌不同的病理分期的生物标志物，以此来预测膀胱癌的疾病进展，这一分子标志物可能对改善膀胱癌患者的风险分层，治疗决策和预后预测具有重要的临床意义。
第二部分HMGCS2促进生酮作用对膀胱肿瘤细胞生物学行为影响的研究
目的：通过体外细胞实验和体内动物实验探究HMGCS2对膀胱癌细胞增殖和迁移能力的影响。
方法：采用qPCR和westernblot检测不同膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮细胞中HMGCS2的表达；采用细胞瞬时转染将HMGCS2过表达质粒导入细胞，建立细胞瞬时过表达模型；采用慢病毒包装的HMGCS2过表达质粒和shRNA感染细胞，构建膀胱癌细胞稳定过表达和敲减模型；采用MTT实验和克隆形成实验检测细胞的增殖和克隆能力；采用Transwell实验和划痕实验检测细胞的迁移能力；采用westernblot和免疫荧光检测相关目的蛋白的表达水平；采用β-羟基丁酸检测试剂盒检测细胞中β-羟基丁酸的水平；采用裸鼠皮下荷瘤实验检测肿瘤细胞体内的生长和成瘤能力。
结果：qPRC和westernblot结果显示，与正常膀胱上皮细胞相比，HMGCS2mRNA和蛋白水平在膀胱癌细胞中明显降低；westernblot检测了过表达和敲减细胞系模型中HMGCS2的表达水平，结果显示膀胱癌细胞T24和5637过表达HMGCS2后其蛋白水平明显增高，同时，采用不同shRNA干扰HMGCS2mRNA表达后，其蛋白水平明显降低；β-羟基丁酸检测试剂盒检测HMGCS2过表达和敲低的膀胱癌细胞，发现肿瘤细胞在过表达HMGCS2后，细胞内β-HOB的生成量明显升高，细胞在敲低HMGCS2后，细胞内β-HOB含量明显降低；并且，MTT实验结果显示不同浓度的β-HOB均能够抑制膀胱癌细胞T24的增殖能力；MTT实验和克隆形成结果显示，与对照组(Control)与HMGCS2过表达组(HMGCS2)细胞的增殖和形成克隆能力明显降低，敲低HMGCS2促进膀胱癌细胞的增殖和迁移能力，裸鼠成瘤实验结果显示，敲低HMGCS2在体内也能明显促进肿瘤细胞增殖和生存能力；qPCR，Westernblot和免疫荧光实验结果显示，T24和5637HMGCS2过表达细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白水平均表达增加，在HMGCS2敲低的细胞中，N-钙粘着蛋白和波形蛋白Vimentin的蛋白表达水平显着升高，酮体补充回复HMGCS2下调后细胞的增殖和迁移能力的增强。
结论：HMGCS2通过促进膀胱癌细胞的生酮作用，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力，并且抑制膀胱癌细胞的EMT过程。
第三部分HMGCS2促进生酮作用抑制膀胱癌细胞增殖和迁移的机制研究
目的：探讨HMGCS2基因调节膀胱癌细胞增殖、迁移、EMT改变的机制。
结果：Seahorse糖酵解实验结果显示，膀胱癌细胞T24和5637过表达HMGCS2后，细胞外酸化率(ECAR)明显降低，细胞的糖酵解能力降低，HMCGS2可能可抑制膀胱癌细胞的糖酵解过程；膀胱癌细胞RNA-sequencing结果显示，HMGCS2过表达细胞中上调基因明显富集到细胞周期(Cell cycle)，DNA复制(DNA replication)以及细胞分裂(Cell division)相关的生物学过程，下调基因明显富集到细胞对化学刺激的反应(Cellular response to chemical stimulus),细胞运动(Cell mobility)以及细胞迁移(Cell migration)；β-HOB处理膀胱癌T24细胞和肝癌SNU449细胞后发现，两者的组蛋白β-羟基丁酸酰化水平显著升高。我们同样发现，膀胱癌T24和5637细胞在过表达HMGCS2后，组蛋白β-羟基丁酸酰化水平明显增高，并且SV-HUC-1细胞在敲减HMGCS2后，组蛋白β-羟基丁酸酰化水平降低；Chip实验结果显示，与Control对照组相比，HMGCS2过表达膀胱癌细胞模型中，组蛋白H4β-羟基丁酸酰化与CXCL3、CXCL6、JAM2、FN1、ASTN1和MMP10等基因启动子区域结合增多并抑制基因表达。
方法：采用Seahorse实验检测HMGCS2过表达膀胱癌细胞模型中糖酵解变化；采用RNA-sequencing检测HMGCS2过表达膀胱癌细胞模型中基因和信号通路的变化；采用qPCR实验对RNA-sequencing结果进行验证；采用westernblot检测酮体对组蛋白H4β-羟基丁酸酰化水平的影响；采用westernblot检测HMGCS2过表达模型中组蛋白H4β-羟基丁酸酰化水平的变化；采用染色质免疫共沉淀(Chip)检测组蛋白H4与下游基因启动子区域的结合情况。
结论：HMCGS2可能通过抑制膀胱癌细胞的糖酵解过程，致使细胞产生ATP能力受限，从而抑制细胞的增殖和迁移能力。同时，HMGCS2促进膀胱癌细胞酮体生成增加，促进组蛋白H4β-羟基丁酸酰化水平增高，抑制CXCL3、CXCL6和MMP10等基因的表达，从而抑制膀胱癌细胞增殖和迁移。
目的：采用权重基因共表达网络分析筛选膀胱癌患者基因表达谱与临床病例数据之间的相关性，鉴定与膀胱癌临床特征相关的基因。
方法：从NCBIGeneExpressionOmnibus(GEO)公共数据库筛选膀胱癌表达谱芯片，同时获取了TCGA数据库膀胱癌组织(TCGA BLCA)RNA二代测序结果。采用R包limma筛选差异表达基因。采用WGCNA构建无尺度共表达网络，将基因划分为不同的模块，采用Pearsons相关性计算不同模块与临床特征之间的相关系数，鉴定出与肿瘤临床特征相关性最高的模块(Clinically most related modules )。根据基因显著性(Gene significance)和模块相关性(Modulemembership，筛选目标模块中的关键基因(hubgenes)。采用非配对T检验(unpairedt-test)检测关键基因在不同临床特征之间的差异，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析关键基因在不同肿瘤分期之间的差异。采用膀胱癌组织芯片来检测关键基因的蛋白水平表达。
结果：以FDR＜0.05和差异倍数(Fold Change)绝对值≥1.2为筛选阈值，总筛选出873个差异基因。将差异基因作为目标基因进行WGCNA分析，差异基因表达分布符合无尺度网络条件(Scale-free network)，共鉴定出6个共表达模块,yellow模块与病理分期(stage)和侵袭性(Invasion)均具有最高的相关性(cor=0.5,p=4e-07；cor=0.53,p=4e-06)，确定yellow模块为临床感兴趣的模块(Clinically interested module)，又称关键模块(Key module)。在关键模块中，总共鉴定了19个网络中心基因，进一步通过生存分析、ROC曲线分析以及膀胱癌组织qPCR验证，最终确定HMGCS2与膀胱癌分期和预后相关的关键基因。进一步，利用膀胱癌组织芯片检测HMGCS2蛋白的表达，确定HMGCS2在膀胱癌组织中明显低表达，并且随肿瘤分期越高而表达水平下降。
结论：HMGCS2可能作为鉴别膀胱癌不同的病理分期的生物标志物，以此来预测膀胱癌的疾病进展，这一分子标志物可能对改善膀胱癌患者的风险分层，治疗决策和预后预测具有重要的临床意义。
第二部分HMGCS2促进生酮作用对膀胱肿瘤细胞生物学行为影响的研究
目的：通过体外细胞实验和体内动物实验探究HMGCS2对膀胱癌细胞增殖和迁移能力的影响。
方法：采用qPCR和westernblot检测不同膀胱癌细胞以及正常膀胱上皮细胞中HMGCS2的表达；采用细胞瞬时转染将HMGCS2过表达质粒导入细胞，建立细胞瞬时过表达模型；采用慢病毒包装的HMGCS2过表达质粒和shRNA感染细胞，构建膀胱癌细胞稳定过表达和敲减模型；采用MTT实验和克隆形成实验检测细胞的增殖和克隆能力；采用Transwell实验和划痕实验检测细胞的迁移能力；采用westernblot和免疫荧光检测相关目的蛋白的表达水平；采用β-羟基丁酸检测试剂盒检测细胞中β-羟基丁酸的水平；采用裸鼠皮下荷瘤实验检测肿瘤细胞体内的生长和成瘤能力。
结果：qPRC和westernblot结果显示，与正常膀胱上皮细胞相比，HMGCS2mRNA和蛋白水平在膀胱癌细胞中明显降低；westernblot检测了过表达和敲减细胞系模型中HMGCS2的表达水平，结果显示膀胱癌细胞T24和5637过表达HMGCS2后其蛋白水平明显增高，同时，采用不同shRNA干扰HMGCS2mRNA表达后，其蛋白水平明显降低；β-羟基丁酸检测试剂盒检测HMGCS2过表达和敲低的膀胱癌细胞，发现肿瘤细胞在过表达HMGCS2后，细胞内β-HOB的生成量明显升高，细胞在敲低HMGCS2后，细胞内β-HOB含量明显降低；并且，MTT实验结果显示不同浓度的β-HOB均能够抑制膀胱癌细胞T24的增殖能力；MTT实验和克隆形成结果显示，与对照组(Control)与HMGCS2过表达组(HMGCS2)细胞的增殖和形成克隆能力明显降低，敲低HMGCS2促进膀胱癌细胞的增殖和迁移能力，裸鼠成瘤实验结果显示，敲低HMGCS2在体内也能明显促进肿瘤细胞增殖和生存能力；qPCR，Westernblot和免疫荧光实验结果显示，T24和5637HMGCS2过表达细胞中E-cadherin的mRNA和蛋白水平均表达增加，在HMGCS2敲低的细胞中，N-钙粘着蛋白和波形蛋白Vimentin的蛋白表达水平显着升高，酮体补充回复HMGCS2下调后细胞的增殖和迁移能力的增强。
结论：HMGCS2通过促进膀胱癌细胞的生酮作用，抑制肿瘤细胞的增殖和迁移能力，并且抑制膀胱癌细胞的EMT过程。
第三部分HMGCS2促进生酮作用抑制膀胱癌细胞增殖和迁移的机制研究
目的：探讨HMGCS2基因调节膀胱癌细胞增殖、迁移、EMT改变的机制。
结果：Seahorse糖酵解实验结果显示，膀胱癌细胞T24和5637过表达HMGCS2后，细胞外酸化率(ECAR)明显降低，细胞的糖酵解能力降低，HMCGS2可能可抑制膀胱癌细胞的糖酵解过程；膀胱癌细胞RNA-sequencing结果显示，HMGCS2过表达细胞中上调基因明显富集到细胞周期(Cell cycle)，DNA复制(DNA replication)以及细胞分裂(Cell division)相关的生物学过程，下调基因明显富集到细胞对化学刺激的反应(Cellular response to chemical stimulus),细胞运动(Cell mobility)以及细胞迁移(Cell migration)；β-HOB处理膀胱癌T24细胞和肝癌SNU449细胞后发现，两者的组蛋白β-羟基丁酸酰化水平显著升高。我们同样发现，膀胱癌T24和5637细胞在过表达HMGCS2后，组蛋白β-羟基丁酸酰化水平明显增高，并且SV-HUC-1细胞在敲减HMGCS2后，组蛋白β-羟基丁酸酰化水平降低；Chip实验结果显示，与Control对照组相比，HMGCS2过表达膀胱癌细胞模型中，组蛋白H4β-羟基丁酸酰化与CXCL3、CXCL6、JAM2、FN1、ASTN1和MMP10等基因启动子区域结合增多并抑制基因表达。
方法：采用Seahorse实验检测HMGCS2过表达膀胱癌细胞模型中糖酵解变化；采用RNA-sequencing检测HMGCS2过表达膀胱癌细胞模型中基因和信号通路的变化；采用qPCR实验对RNA-sequencing结果进行验证；采用westernblot检测酮体对组蛋白H4β-羟基丁酸酰化水平的影响；采用westernblot检测HMGCS2过表达模型中组蛋白H4β-羟基丁酸酰化水平的变化；采用染色质免疫共沉淀(Chip)检测组蛋白H4与下游基因启动子区域的结合情况。
结论：HMCGS2可能通过抑制膀胱癌细胞的糖酵解过程，致使细胞产生ATP能力受限，从而抑制细胞的增殖和迁移能力。同时，HMGCS2促进膀胱癌细胞酮体生成增加，促进组蛋白H4β-羟基丁酸酰化水平增高，抑制CXCL3、CXCL6和MMP10等基因的表达，从而抑制膀胱癌细胞增殖和迁移。