三七为五加科人参属植物,根入药。三七总皂苷(totalsaponinsofPanax notoginseng,PNS)是三七的主要药用成分。已有研究表明三七总皂苷在中枢神经系统、心脑血管系统、血液系统、免疫系统以及抗纤维化、抗衰老、抗肿瘤等方面均具有较好的药理活性。三七为多年生草本植物,这种生长周期长,土地利用率低下的现状,严重阻碍了三七产业的发展。随着三七皂苷生物合成途径研究的不断深入,通过代谢工程手段调控三七皂苷的生物合成逐步成为可能。为了快速大量获得低生产率,高附加值的天然药物,可采用组合生物合成技术建立同源(植物细胞培养)或异源(基因工程菌)表达系统高效生产药用活性成分。本课题利用分子生物学技术研究三七中S(鲨烯合成酶)和DS(达玛烯二醇合成酶)基因在皂苷生物合成途径中的共同作用。SS和DS是三七皂苷代谢途径中最关键的两个酶。本研究首先利用反转录PCR从三七总RNA中扩增出SS基因全长片段,构建pGEM-T-SS克隆载体。再用限制性内切酶分别双酶切克隆载体和pCAMBIA1300S空载体,将SS片段与pCAMBIA1300S相连,成功构建了 pCAMBIA1300S-SS植物超表达载体。采用氯化钙冻融法将pCAMBIA1300S-SS超表达载体分别转入农杆菌LBA4404和EHA105菌株感受态细胞中。以超表达DS基因三七细胞为材料,利用根癌农杆菌对其侵染,将SS基因导入并整合到已超表达DS基因的三七细胞基因组中,建立起基于三七愈伤组织的遗传转化体系。转化获得的愈伤组织在含卡那霉素(Kan)和潮霉素(HygB)培养基上筛选,经过3次筛选,对生长较快且状态良好的细胞系进行PCR检测,表明有5株细胞系成功转入SS基因。利用荧光定量PCR技术检测其中3株长势较好转基因细胞系中SS和DS基因表达情况,3株转双基因三七细胞系(TE-1、TE-2、TE-3)中有两株细胞系的DS基因表达量略高于对照(DS超表达三七细胞),分别为1.41倍和1.39倍,一株细胞系的DS基因表达量高于对照(2倍),说明DS基因的表达量受SS基因超表达有少许促进作用。三株转双基因三七细胞系的SS基因表达量显著高于对照(5.66倍、7.37倍和7.46倍),表明所转入的SS基因在三七基因组中成功整合,且表达量大幅提高。为进一步明确双基因(SS和DS基因)共超表达在三七皂苷生物合成途径中的作用,选取2株生长速度较快的转双基因细胞系,测定其三七总皂苷和单体皂苷含量。转双基因(SS和DS基因)三七细胞系中总皂苷含量约为普通细胞的2.4倍,同时也是转单基因(DS基因)的1.3倍。说明双基因共超表达能进一步提高三七总皂苷的含量,这些试验结果说明SS、DS基因的超表达有利于三七总皂苷的积累。