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背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种病因不明的以慢性破坏性关节病变为特征的全身自身免疫性疾病,以双手、腕、膝、踝和足关节的对称性多关节受累为主,我国的患病率大约为0.32%～0.36%。病理上表现为关节滑膜的慢性炎症、增生形成血管翳,侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等,造成患者关节软骨、骨和关节囊的破坏,最终导致关节畸形和功能丧失,甚至还会造成机体其他器官,如肺、心脏、眼、肾脏等内脏的病变。在本实验室的前期工作中,我们已经熟练掌握了人滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)的原代培养,摸索并确定了通过电转染的方法将人FLS的p53基因表达进行干扰的最佳条件[1]。目的:本研究工作将经过p53 siRNA(small interfering RNA)干扰处理后的人FLS和RA患者的外周静脉血中的CD4~+T淋巴细胞共同培养,检测FLS经干扰后的相应生物学变化和其对CD4~+T淋巴细胞亚群Th17、Treg、Th1及Th2的影响,初步探讨RA的病因及病理生理变化。本论文工作主要研究内容包括两部分:(一)FLS内p53表达干扰后对共培养的CD4~+T淋巴细胞亚群的影响方法:将人FLS内p53基因用siRNA技术干扰后的第三天,利用磁珠筛选技术得到CD4~+T淋巴细胞,将其与FLS共同培养48h。收集所有细胞,用流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测CD4~+T淋巴细胞亚群Th17、Treg、Th1及Th2四大成分的改变。用RT-PCR(Reverse transcription-Polymerase chain reaction)方法在mRNA水平上对IFNγ、RORγt、IL17、Foxp3的表达水平差异进行分析。结果:人关节FLS内p53基因被干扰后,会造成Th1、Th17细胞在CD4~+T淋巴细胞亚群中百分比含量的增加,而Th2、Treg细胞没有明显变化。(二)FLS内p53表达干扰后FLS的生物学改变方法:将人FLS内p53基因用siRNA技术干扰后第五天,收集细胞群,提取总RNA,用RT-PCR方法在mRNA水平上研究细胞因子护骨素(osteoprotegerin,OPG)表达水平的差异。并用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)方法检测细胞培养上清中IL6等细胞因子含量的差异。结果:人关节FLS内p53基因被干扰后,OPG表达量没有明显变化,而IL6表达水平下调。结论:1.FLS内p53基因敲除后,会引起CD4~+ T淋巴细胞中Th1、Th17细胞亚群的增加,对Th2、Treg细胞亚群无明显影响;2.FLS内p53基因敲除后,OPG表达量没有明显变化,而IL6的分泌量下降。