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目的肺动脉高压（Pulmonary artery hypertension，PAH）是与许多心肺血管疾病相关的一种危及生命的并发症，亦是心血管外科围手术期难题之一。临床上表现为进行性肺动脉压力增高，右心功能下降，最后导致右心功能衰竭而死亡。引发PAH的原因很多，其中慢性缺氧是PAH的重要原因，并在病程的发展过程中亦起着重要的作用。慢性缺氧性肺动脉高压（Chronic hypoxic pulmonary hypertension，CHPH）主要见于慢性阻塞性肺疾病，分流性先天性心内畸形等疾病，其发生发展主要包括三个重要病理过程：即肺血管收缩、肺血管结构重建和原位血栓形成。NO（nitric oxide，NO）作为内皮衍化舒张因子（Endothelium derived relaxing factor，EDRF），在内皮血管舒张中起重要作用，因其直接松弛肺血管平滑肌，从而产生明显的肺血管舒张，并且具有抑制肺血管平滑肌细胞的增殖和迁移，抑制血小板聚集等作用，在维持肺循环稳定中起重要的作用。NO生成或作用不足与PAH的发病息息相关，故对PAH病人重建NO功能有着十分重要的意义。一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）是NO合成中关键的限速酶，业已证实，NO的合成受内皮细胞中NOS的表达及其活性的调节。在调节正常和低氧肺循环中，内皮型NOS（eNOS）起主要的作用。美国FDA已经核准，可将NO用于PAH的治疗。然而，NO生物半衰期短（15～30s）、易产生耐受性、副作用明显且使用不便等而使其临床应用受限。随着基因工程及NO体系分子生物学研究的进展，应用重组eNOS基因转染治疗PAH已成为可能。近年来，通过NOS基因转移的方式来恢复NO的生成，在体内和体外重组NOS基因异构体的表达均取得了重建NO功能，发挥降低肺动脉压力的治疗作用。目前此类研究正方兴未艾，很可能成为今后治疗PAH最有潜力的新方法。据目前所知，实现外源基因导入治疗PAH的途径，可通过血管内皮、外膜以及呼吸道上皮等。本研究通过建立CHPH模型，并经呼吸道途径将AdCMVceNOS转染入大鼠体内。旨在探讨重组eNOS转基因治疗PAH的可行性、效果及其可能机制，为基因治疗PAH的临床应用提供理论依据。材料1．实验动物雄性Wistar大鼠150只，体重220～280g，由沈阳军区总医院实验动物中心提供。实验主要仪器小型动物呼吸机（Harvard 638型，美国）；多功能监测仪（Datex Ohmeda S／5，芬兰）；压力换能器（Edwards LifeSciences，美国）；低温高速离心机（Sorvall ST—70，美国）；台式离心机（Sigma，美国）；JUNG—CM1800型切片机（上海）；超声粉碎机及水平电泳仪（Biorad，美国）；水浴式电转印槽（DYY—Ⅲ40B型，北京六一仪器厂）；生化培养箱（LRH—150B，广州医疗器械厂）；K—8D电热恒温水浴槽（上海精宏实验设备有限公司）；Olympus光学显微镜（日本）；微量加样器（德国GILSON公司）；分析天平（上海天平仪器厂）；PTC—100型PCR仪（美国）；紫外分光光度计（德国EPPENDORF公司）；N02120MAX21g电子天平（NAVIGATOR公司）；PE 7000全自动荧光定量PCR仪（美国Perkin Elmer公司）；凝胶自动分析成像系统（Chem image 5500，美国）。实验试剂小鼠抗人eNOS单克隆抗体（BD公司）；ECL试剂盒（北京中杉生物技术公司）；重组腺病毒载体AdCMVceNOS质粒DNA（由Dr Robert Gerard惠赠）；pXC1载体（加拿大Microbix Biosystems公司）；腺病毒E1区转化人胚胎肾细胞株293（加拿大Microbix Biosystems公司）；琼脂糖、溴化乙锭（GENE公司）；一氧化氮试剂盒（南京建成生物公司）；Trizol（Invitrogen公司）；RT PCR试剂盒（德国QIAGEN公司）；定量PCR buffer（美国ABI公司）；dNTPs（Sigma公司）；荧光探针（上海生工）；Taq酶（美国ABI公司）。方法1．eNOS／NO体系在CHPH大鼠中的变化：选用雄性Wistar大鼠50只，随机分为5组。常氧组（N组），低氧7天组（H7d），低氧14天组（H14d），低氧21天组（H21d），低氧28天组（H28d），每组10只。低氧组大鼠置于常压低氧箱内，将氮氧混合气（90％N2和10％O2的混合气）通入低氧箱，箱内放置变色硅胶和无水氯化钙吸收二氧化碳和水份。在麻醉气体监测仪监测下，使氧浓度平衡在（10.0±0.5）％，CO2浓度为（3.0±0.5）％。每天置人8h，依其分组，分别在常压低氧箱内饲养7、14、21和28天。常氧组除吸空气外，饲养条件同低氧各组。测定各组颈外动脉压、肺动脉压、肺动脉血NO含量、eNOS蛋白表达，并用弹力纤维染色观察肺血管构型的改变。2．重组腺病毒介导的eNOS基因在大鼠肺内的转染：雄性Wistar大鼠60只，随机分为对照组（N组）和重组eNOS基因转染组（T组）。T组通过呼吸道将总量为3×109pfu重组eNOS基因转导入大鼠肺内，N组只导入等容量病毒稀释液。T组又分为转染后第2、5、7、14、21五个亚组，即T2d组，T5d组，T7d组，T14d组，T21d组。每组10只。观测各组外源性转染的eNOS基因表达情况以及肺动脉血NO含量。3．eNOS基因转染治疗CHPH：雄性Wistar大鼠40只，慢性缺氧3周后，随机分为缺氧组（H组）和重组eNOS基因转染组（T组），T组通过呼吸道转入AdCMVceNOS，H组只导入等容量病毒稀释液。T组又分为三个亚组，低剂量组（TL组）、中剂量组（TM组）和高剂量组（TH组），接受病毒载体总量分别为1×109pfu、3×109pfu和5×109pfu。观测各组颈外动脉压、肺动脉压变化，并检测肺动脉血NO含量，观测外源性转染的eNOS基因在肺内的表达情况以及肺血管构型的改变。结果1．各组平均颈外动脉压（mCAP）相比无显著性差异（P＞0.05）。2．与常氧组（N组）相比：H14d组、H21d组和H28d组平均肺动脉压（mPAP）明显增加（P＜0.05），尤以H21d组mPAP最高，与H14d组相比有统计学差异（P＜0.05）；H21d组和H28d组eNOS蛋白表达A值明显增加（P＜0.05）；肺动脉血中NO含量明显降低（P＜0.05）；H21d和H28d组无肌型动脉（None muscle artery，NMA）百分比较N组、H7d组和H14d组明显减少，环肌型动脉（Circular muscle artery，CMA）百分比明显增加（P＜0.05）。3．与未转染AdCMVceNOS组（N组）相比：T2d组、T5d组、T7d组、T14d组和T21d组肺组织中eNOS蛋白含量，总RNA含量，肺动脉血中NO含量明显增加（P＜0.05）。T7d组与T2d组相比有统计学差异（P＜0.05）。4．与单纯缺氧后3W未转入AdCMVceNOS组（H组）相比：TM组和TH组mPAP明显降低（P＜0.05）；肺组织中eNOS蛋白含量、总RNA含量、肺动脉血中NO含量明显增加（P＜0.05）。TM组和TH组NMA较H组明显增加，CMA明显减少（P＜0.05）。5．T7d组肝、脾、肾无eNOS阳性表达。6．TH组肺组织有炎性浸润表现。结论1．由eNOS质的缺陷引起的eNOS／NO体系功能障碍，是CHPH形成的主要原因。2．经气道途径，通过重组腺病毒介导，实现了外源eNOS基因在肺脏的充分表达。3．基因表达起效时间快（2天），于7天达高峰，并可持续21d或以上。4．基因表达的靶向性高，无远隔器官表达。5．基因表达产物稳定，具备正常的酶学活性。6．在一定剂量范围内，基因表达效率与腺病毒载体剂量呈正相关。以载体剂量为3×109pfu较为适宜，不仅基因表达效率高且不引发不良反应。7．通过呼吸道途径介导的AdCMVceNOS转基因，对CHPH具有显著治疗作用。8．AdCMVceNOS治疗CHPH的作用是通过NO介导的，即通过重建eNOS／NO系统功能，并减轻肺血管收缩及肺血管重构而实现的。