妊娠期高血压疾病(Hypertensive disorders complicating pregnancy,HDP)是妊娠期常见的特有并发症,影响我国高达9.4%～10.4%的妊娠妇女,子痫前期(Preeclampsia,PE)是其常见并严重的类型。近年来,妊娠期高血压疾病已成为孕产妇与围产儿发病率、近远期死亡率增高的主要原因。其严重的并发症为脏器功能障碍、胎盘早剥、弥漫性血管内凝血等,可导致胎儿生长受限、早产、缺氧神经损伤、围产儿死亡或早产相关的长期风险。目前的治疗重点是密切监测病情变化,酌情终止妊娠。至今尚未发现安全有效的预防和治疗子痫前期的药物,唯一有效的治疗是胎盘娩出。Apelin,又名APLN,是近年发现的一种具有多种生物学功能的血管活性肽,其功能的实现由孤儿G蛋白偶联受体(apelin peptide of G protein coupled receptors,APJ)介导,参与调节心血管系统稳态、扩张血管、调节水盐代谢以及介导免疫调节等多种生物学效应。已证实apelin存在多种亚型,具有相似功能,这些亚型中短肽比长肽活性更强,且分布于不同组织,在心血管系统中以apelin-13和apelin-36活性最强。减少胎盘灌注压(reduction in uteroplacental perfusion,RUPP)大鼠模型在模拟子痫前期的高血压、氧化应激及胎儿生长受限方面最贴近,在其它物种也能成功地被复制。该模型为研发子痫前期病因及潜在的治疗方法提供了有力的工具。目前国内外尚未见apelin在RUPP大鼠模型中的研究报道。本研究的目的是希望通过外源性apelin来改善子痫前期的临床表现和妊娠结局。我们做了如下三部分研究:1)子痫前期患者血清和胎盘组织apelin的表达水平及其意义;2)Apelin对RUPP大鼠模型临床表现及妊娠结局的影响;3)Apelin改善RUPP大鼠模型临床表现及妊娠结局的作用机制探讨。本研究旨在探讨apelin在子痫前期患者体内的变化及其意义,应用RUPP大鼠模型证实apelin应用于子痫前期治疗的效果并探讨其可能的作用机制。第一部分子痫前期患者血清及胎盘组织中apelin的表达水平及其意义目的:研究子痫前期患者外周血清、脐血清及胎盘组织中apelin水平及胎盘组织APJ水平的变化,以及apelin与胎盘、胎儿生长发育的关系,探讨apelin在子痫前期发病中的作用。方法:收集子痫前期患者(PE组,28例)和健康孕妇(N组,20例)的外周血清、脐血清和胎盘组织。采用ELISA法检测孕妇外周血清apelin、血管内皮生长因子-A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)、可溶性血管内皮生长因子(soluble fms-like tyrosine kinase receptor-1,sFlt-1)及脐血清中apelin水平;化学法检测孕妇外周血清中脂质氧化终产物丙二醛(malondialdehyde,MDA)、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)水平;免疫组织化学法检测胎盘组织中apelin与APJ表达情况。结果:1两组的一般情况。PE组28例,平均年龄为27.46±4.63岁,体重指数(body mass index,BMI)为28.90±4.17kg/m2,N组20例,平均年龄为28.40±4.04岁,BMI为28.18±2.90kg/m2;两组比较差异无统计学意义(P>0.05),表明两组具有可比性。1.1两组临床指标PE组血压明显升高(均大于140/90mmHg),收缩压为166.25±16.03mmHg,舒张压为 107.89±12.38mmHg,平均动脉压为127.35±11.18mmHg;N组血压均在正常范围(均低于140/90mmHg),收缩压为117.75±11.84mmHg,舒张压为76.10±8.44mmHg,平均动脉压为89.99±9.15mmHg。两组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。PE组患者尿蛋白定性及定量表现为+～+++及大于2g/24h,N组孕妇没有或仅有微量蛋白尿,即阴性或trace,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。1.2两组新生儿胎龄、新生儿体重及胎盘重量PE组与N组新生儿胎龄分别为35.82±2.10周、37.21 ± 1.11周,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。PE组的体重新生儿体重重为1958.90±466.05g,N组的体重新生儿体重重为3290.00±442.96g,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。该结果表明PE组出生的新生儿易发生宫内生长受限或小于胎龄儿。PE组的胎盘重量为321.89±98.12g,N组的胎盘重量为551.15±78.34g,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05),该结果表明PE组胎盘发育不良。2两组外周血清apelin、VEGF-A、sFlt-1、MDA、T-AOC水平及脐血清中apelin水平,以及胎盘组织中apelin、APJ蛋白表达水平的比较2.1 apelin 水平PE组患者外周静脉血清中apelin水平为70.08±11.35pg/ml,N组为46.27±7.40pg/ml,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。PE组患者新生儿脐血清中apelin水平为71.20±7.90pg/ml,N组为59.55±3.44pg/ml,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。胎盘组织免疫组化显示apelin和APJ在PE组胎盘组织滋养层细胞质中淡染低表达,其平均光密度值(mean optical density,MOD)均显著低于N组(0.28±0.04vs.0.20±0.03、0.29±0.07vs.0.22±0.04),两组分别比较,差异均具有统计学意义(P<0.05)。2.2 VEGF-A水平PE组患者外周静脉血清中VEGF-A水平为55.22±6.55pg/ml,N组为72.29±11.86pg/ml,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.3 sFlt-1 水平PE组患者外周静脉血清中sFlt-1水平为236.15±47.44pg/ml,N组为26.82±5.90pg/ml,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.4 MDA水平PE组患者外周静脉血清中MDA水平为3.73±0.66umol/L,N组为2.87±0.65umol/L,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。2.5 T-AOC水平PE组患者外周静脉血清中T-AOC水平为10.35±1.35U/ml,N组为13.49±1.71U/ml,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。3新生儿出生体重、胎盘重量与孕妇外周血清、新生儿脐血清及胎盘组织中apelin表达水平的相关性分析新生儿出生体重与脐血清、孕妇血清apelin水平呈负相关(r=-0.560,P>0.05;r=-0.662,P>0.05),与胎盘组织apelin水平呈正相关(r=0.447,P>0.05);胎盘重量与孕妇血清apelin水平呈负相关(r=-0.469,P>0.05)、与胎盘组织apelin水平呈正相关(r=0.293,P>0.05);胎盘重量与新生儿体重呈正相关(r=0.742,P>0.05)。小结:1子痫前期患者外周血及脐带血中apelin水平增高,而胎盘组织中apelin/APJ系统表达降低,apelin的这些变化与新生儿低出生体重和低胎盘重量相关,说明apelin与子痫前期的发病有关。2子痫前期患者外周血VEGF-A、sFlt-1、MDA、T-AOC水平与正常孕妇相比均有明显变化,说明apelin可能通过影响氧化应激状态和血管内皮细胞功能发挥作用。第二部分外源性apelin对RUPP大鼠模型临床表现和妊娠结局的影响目的:本研究通过建立RUPP大鼠模型,观察比较apelin处理组是否能改善子痫前期的临床表现和妊娠结局。方法:购买体重160-200g(大约3月龄)、清洁级SpragueDawley(SD)大鼠建立RUPP大鼠模型。孕14天时,将孕鼠(体重200-250g)随机分为4组,分别为假手术组(N组,6例)、RUPP手术组(PE组,7例)、假手术组+apelin-13组(APLN组,7例)、RUPP手术+apelin-13组(PE+APLN组,8例)。从孕14天起,APLN组及PE+APLN组皮下注射apelin-13、剂量100ug/kg、2次/日、连续5天。在孕18天时,行颈动脉置管,并将孕鼠置入代谢笼中开始收集24小时尿量。在孕19天时,测量孕鼠血压及心脏功能、胎盘胎儿体重、留取大鼠血清及胎盘组织标本。观察孕鼠血压及心脏功能变化、胎盘形态学变化、胎儿存活情况及体重变化、ELISA法检测孕鼠血清中VEGF-A及sFlt-1水平。结果:1血流动力学的变化N组收缩压为124.00±7.59mmHg、舒张压为74.83±6.21mmHg、平均动脉压为91.51 ±6.76mmHg,PE组收缩压149.00±5.80mmHg、舒张压103.14±3.24mmHg、平均动脉压118.36±4.10mmHg;两组分别比较,差异均有统计学意义。RUPP组左心室收缩内压(LVESP)、左心室最大收缩速率(LV+dp/dtmax)较 N 组均降低(107.21±12.95 vs.122.18±6.61mmHg;1829.50±513.74 vs.2641.67±314.23mmHg/s),而左心室舒张末压(LVEDP)明显增高(2.55±2.48 vs.-4.89±1.72mmHg),差异均有统计学意义(P<0.05)。PE+APLN 组收缩压为 139.38±4.03mmHg、舒张压为88.50±8.42mmHg、平均动脉压为105.46±6.44mmHg,与PE组比较均显著降低(P<0.05);PE+APLN 组 LVESP、LV+dp/dtmax 均较 PE 组升高(129.51±8.01 vs.107.21±12.95mmHg;2568.12±393.70 vs.1829.50±513.74mmHg/s),而LVEDP明显降低(-0.66±1.37 vs.2.55±2.48mmHg),差异均有统计学意义(P<0.05);APLN组上述参数与N组比较均无统计学意义(P>0.05)。2尿蛋白定量N组24小时尿蛋白定量为2.79±0.53mg,PE组为4.79±0.75mg,两组差异具有统计学意义(P<0.05),N组尿蛋白并没有呈阴性,这与人类不同[13]。PE+APLN组24小时尿蛋白定量为4.03±0.76mg,比PE组低,两组差异具有统计学意义(P<0.05)。APLN组24小时尿蛋白定量为2.44±0.52 mg,比N组低,但两组差异无统计学意义(P>0.05)。3胚胎存活率N组孕鼠的胚胎存活率为100%,PE组的胚胎存活率为0.32±0.12;PE+APLN组为0.46±0.17,比PE组升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。4存活胚胎体重N组存活胚胎平均体重为2.17±0.21g,PE组为1.98±0.29g,两组差异具有统计学意义(P<0.05);PE+APLN组存活胚胎平均体重为2.16±0.24g,比PE组增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。5存活胚胎的胎盘重量N组的胎盘重量为0.42±0.06g,PE组为0.36±0.07g,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05);PE+APLN组胎盘重量为0.40±0.05g,比PE组增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。6胎盘形态学变化大鼠胎盘结构从母面到子面分为四层,分别为蜕膜层、巨细胞滋养层、海绵滋养层和迷路滋养层。绒毛位于迷路滋养层中,呈树状分支,外层一般由三层滋养细胞覆盖,轴心为富含血管的结缔组织。HE染色结果显示,在大鼠胎盘的各部分结构中,绒毛部分在组间的差异最大。与N组比较,PE组的绒毛水肿、细胞排列较乱、细胞核大小不一、深染;PE+APLN组胎盘绒毛的水肿减轻,细胞排列较齐整,深染区减少。在电镜观察下,PE组内质网扩张、线粒体嵴和膜融合消失、可见糖原;PE+APLN组内质网扩张、部分线粒体嵴和膜融合消失、富含糖原。7血清中VEGF-A及sFlt-1水平变化。PE组血清VEGF-A水平比N组减低(22.14±3.77 vs.29.51±5.27pg/ml),差异有统计学意义(P<0.05);而PE+APLN组VEGF-A水平(15.57±3.90pg/ml)比PE组和N组均减低,差异均有统计学意义(P<0.05)。PE组血清sFlt-1水平比N组增高(4.37±0.92vs.2.98±0.86pg/ml),差异有统计学意义(P<0.05),而PE+APLN组血清sFlt-1水平(4.52±0.97pg/ml)与PE组相比差异无统计学意义(P>0.05)。小结:1本实验的RUPP大鼠模型成功模拟了子痫前期的主要临床表现。2 Apelin可有效改善PE组孕鼠的血流动力学参数、胚胎存活率及胎盘胎体重量。第三部分Apelin改善RUPP大鼠模型临床表现及妊娠结局的机制探讨目的:探讨外源性apelin在改善RUPP大鼠模型临床表现及妊娠结局过程中大鼠体内氧化应激状态及一氧化氮信号通路的变化,期望为apelin的作用机制提供依据,也为子痫前期的防治探索提供新思路。方法:化学法检测大鼠血清一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血清总抗氧化能力(T-AOC)和血清脂质氧化终产物丙二醛(MDA)水平;RT-PCR检测胎盘组织中eNOSmRNA水平;Western-blot检测胎盘组织中eNOS蛋白表达水平。结果:1 Apelin对RUPP大鼠模型血清NO产物及eNOS活性的影响PE组血清NO产物比PE组均降低(36.02±5.89vs.45.75±6.26umol/l),差异具有统计学意义(P<0.05);PE+APLN组血清NO产物水平(44.01±5.15umol/l)比PE组高,差异具有统计学意义(P<0.05)。PE组血清eNOS活性比PE组均降低(7.65±1.40vs.13.35±3.08U/ml),差异具有统计学意义(P<0.05);PE+APLN组血清eNOS活性(11.05±1.68 U/ml)比PE组高,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 Apelin对胎盘组织中eNOS mRNA和蛋白表达水平的影响PE组胎盘组织中eNOS mRNA水平低于N组(0.52±0.06 vs.0.66±0.05),差异具有统计学意义(P<0.05),蛋白表达水平也比N组减低;PE+APLN组胎盘组织中eNOS mRNA水平(0.73±0.09)高于PE组,差异具有统计学意义(P<0.05),蛋白表达水平也比PE组增高。3 Apelin对RUPP大鼠模型血清T-AOC及MDA水平的影响PE组血清T-AOC水平比N组降低(7.20±0.88vs.8.39±1.04U/ml),差异具有统计学意义(P<0.05);PE+APLN组血清T-AOC水平(8.78±1.00 U/ml)比PE组增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。PE组血清MDA水平比N组升高(0.55±0.09vs.0.41±0.05umol/l),差异具有统计学意义(P<0.05);PE+APLN组血清MDA水平(0.44±0.08 umol/1)比PE组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。小结:1 Apelin可增加RUPP大鼠模型外周血T-AOC水平并降低MDA水平,说明改善子痫前期大鼠的氧化应激状态可能是Apelin的作用机制之一。2 Apelin可能通过提高RUPP大鼠模型外周血eNOS活性和NO产物的水平来改善其子痫前期病情。结论:1子痫前期患者外周血及脐带血中apelin水平增高而胎盘组织中apelin/APJ系统表达降低,外周血VEGF-A、sFlt-1、MDA、T-AOC水平也与正常孕妇不同,而apelin的改变与低出生体重和低胎盘重量相关,说明apelin与子痫前期的发病有关,而apelin可能通过影响胎盘血管内皮细胞的功能和脂质过氧化物的代谢发挥作用。2 RUPP大鼠模型可成功模拟子痫前期的主要临床表现,而外源性应用apelin可有效改善子痫前期孕鼠血液动力学参数、胚胎存活率及胚胎重量。3 Apelin可提高RUPP大鼠模型外周血eNOS活性和NO产物的水平,也可增加模型孕鼠外周血T-AOC水平并降低其MDA水平,说明提高子痫前期大鼠NO水平和改善氧化应激状态可能是Apelin的作用机制。