论文部分内容阅读
大肠杆菌是寄宿在人体肠道内的正常菌群,但部分血清型的大肠杆菌对人体是致病的,致病性的大肠杆菌可对人体造成多种疾病,如轻度腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒症、尿路致病性感染等疾病。CRISPR/Cas系统是原核生物中发现的一种适应性免疫系统,其具有高度的多态性,利用CRISPR位点的多态性可实现对大肠杆菌分型。目的1通过生物信息学方法揭示大肠杆菌的结构特征,描述CRISPR/Cas系统与插入序列之间的位置关系,探讨CRISPR1及CRISPR2.2位点之间的关系。2建立基于CRISPR的大肠杆菌分子分型方法,比较CCT、CLPST、MLST、Serotype四种分型方法的分型效果,分析四种分型方法之间的关系。3利用CRISPR分型方法预测大肠杆菌血清型,并评估其灵敏度及特异度。方法1 CRT软件及CRISPR finder在线工具获得CRISPR位点信息,并提取间隔序列及重复序列,RNA fold进行重复序列二级结构预测,CRISPR Target软件进行间隔序列外源同源性搜索,Mega 6.0绘制系统发育进化树。2 Serotype Finder在线工具获得菌株血清学信息,Virulence Finder在线工具获得菌株毒力基因信息,MLST Finder在线工具获得菌株MLST信息。3 Excel表对间隔序列进行编号并绘制间隔序列图谱,R软件获得CRISPR分型型别。4辛普森指数被用于评估CCT、CLPST、MLST、Serotype四种分型方法的分型效果,Spearman相关性分析被用于获得四种分型方法的相关系数。结果1大肠杆菌CRISPR位点的生物信息学分析:283株全基因组测序的大肠杆菌可识别7种CRISPR位点,其中CRISPR1位点阳性率为81.62%,CRISPR2.1位点阳性率为88.69%,CRISPR2.2位点阳性率为88.70%,CRISPR2.3位点阳性率为7.42%,CRISPR3位点阳性率5.65%,CRISPR4位点阳性率为5.65%,CRISPR3-4位点阳性率为93.28%。IS可插入到CRISPR/Cas系统周围,也可插入到Cas基因中,甚至于插入到重复序列之间。2基于CRISPR的大肠杆菌分子分型方法的建立:根据CCT分型方法可获得430个型别,根据CLPST分型方法可获得215个型别,CCT、CLPST、MLST及Serotype四种分型方法的辛普森指数分别为0.8864,0.8760,0.8581,0.8643。3间隔序列组成及排布方式与血清分型及stx噬菌体的关系:stx噬菌体可在各CRISPR亚型中出现,并未发现菌株间隔序列排布方式与分离来源、分离时间及分离地区有关。4 CRISPR分型方法在预测大肠杆菌血清型中的应用:CRISPR分型方法预测O157:H7或NM、O104:H4、O16:H48、O5:H9、O111:H8或NM、O121:H19、O103:H2及O45:H2血清型的灵敏度及特异度可达到95%以上,而对于预测O26:H11或NM血清型的灵敏度及特异度较低。结论1 CRISPR/Cas系统在大肠杆菌中广泛存在。2大肠杆菌的CRISPR/Cas系统中存在着IS的插入现象。3 CRISPR分型方法区分大肠杆菌能取得较好的效果。4 CRISPR分型可用于预测部分大肠杆菌血清型。