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抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)是一类存在于多种生物先天免疫系统中,并由特定基因编码的具有抑菌活性的小分子多肽。在抗生素滥用导致耐药性问题频发的今天,拥有独特作用机理的两栖类皮肤抗菌肽展现了广泛的应用前景。抗菌肽Brevinin-2CE是从中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤中分离的天然抗菌肽,全长是37个氨基酸,一级结构为:GLLSVFKGVLKTAGKNVAKNVAGS LLDQLKCKISGGC。抗菌肽Brevinin-2Ka是从高原林蛙(Ranakukunoris)皮肤中筛选到的天然抗菌肽,全长为33个氨基酸残基,一级结构是:GLLSVFKGVLKTA GKHVAGSLLHQLKCKISGGC。这两种抗菌肽拥有Brevinin-2家族抗菌肽的典型特性,可以抑制常见的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。本研究以 Brevinin-2CE(简称 B2CE)和 Brevinin-2Ka(简称 B2Ka)为模板,利用生物信息学技术,通过序列截短、单个或多个氨基酸替换,对其序列长度、二硫键、电荷数、疏水性、两亲性等特征进行改造,并检测改造肽对细菌、红细胞和真核哺乳动物细胞的活性,研究Brevinin-2家族抗菌肽结构和活性之间的关系。主要结果如下:1、利用生物信息学技术分别对B2CE和B2Ka进行了相似的改造,结果为:通过在合成时不加二硫键或是将半胱氨酸替换为结构相似的丝氨酸,设计了B2CE-nonDS、B2CE-C31,37S 和 B2Ka-nonDS、B2Ka-C27,33S;通过截短 B2CE和 B2Ka 的序列,获得 B2CE-N26、B2-N15 和 B2Ka-N26、B2-N15;分别以 B2CE-N26和B2Ka-N26为模板,通过单个或多个氨基酸替换,设计B2CE-N26-V5K、B2CE-N26-G14K、B2CE-N26-V5KG14K 和 B2Ka-N26-V5K、B2Ka-N26-G14K、B2Ka-N26-V5KG14K,这两组改造肽与模板相比均具有电荷数增加、疏水性降低、两亲性部分增加的特性;另外,根据螺旋轮设计了具有完全亲疏水面的B2CE-N26-N16WA18KG23K 和 B2Ka-N26-H16WA18KG19K;在研究组氨酸和赖氨酸在序列中的不同作用时,设计了 B2Ka-N26-G14KH-K。2、通过检测最小抑菌浓度(MIC)分析抗菌肽对细菌的抑制作用,结果发现:与原始肽B2CE和B2Ka相比,缺失二硫键的改造肽对细菌的抑制作用没有变化,说明二硫键在Brevinin-2抑菌过程中不发挥作用;分别比较B2CE、B2CE-N26、B2-N15和B2Ka、B2Ka-N26、B2-N15两组抗菌肽的抑菌活性,发现随着Brevinin-2序列变短,抑菌活性逐渐降低;与B2CE-N26相比,B2CE-N26-V5K的抑菌活性提高了 1-8倍,而与B2Ka-N26相比,B2Ka-N26-V5KG14K的抑菌活性显著地下降,说明适当地提高电荷数和两亲性、降低疏水性,有利于提高抑菌活性;B2CE-N26-N16WA18KG23K 和 B2Ka-N26-H16WA18KG19K 对检测的菌株均显示强烈的抑制作用,说明两亲性是Brevinin-2发挥抑菌作用的重要因素;与B2Ka-N26-G14K相比,B2Ka-N26-G14KH-K的抑菌活性提高2-6倍,说明赖氨酸相比于组氨酸有利于提高抑菌活性。3、溶血实验检测结果发现:相比于B2CE,B2CE-C31,37S的溶血活性提高了2倍,说明二硫键增强抗菌肽对红细胞的伤害;随着序列的截短,红细胞对抗菌肽敏感度降低;在 B2CE-N26 和 B2Ka-N26 的改造中,B2CE-N26-N16WA18KG23K和B2Ka-N26-H16WA18KG19K展现了极强的溶血活性,说明两亲性是抗菌肽作用于红细胞的重要因素。4、利用MTT法检测了抗菌肽对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒性,结果发现:与原始肽B2CE和B2Ka相比,缺失二硫键的改造肽抑肿瘤细胞活性有轻微的降低,说明二硫键影响抗菌肽抗癌活性的发挥;分别比较B2CE、B2CE-N26、B2-N15和B2Ka、B2Ka-N26、B2-N15两组抗菌肽的抗癌活性,证明随着抗菌肽序列变短,细胞对抗菌肽的敏感度降低;以B2CE-N26和B2Ka-N26为模板的改造肽,其抗癌活性均下降,而B2Ka-N26-H16WA18KG19K的抗癌活性显著提高,证明适度地降低电荷数、提高疏水性和两亲性有利于抗菌肽发挥抗癌作用;B2Ka-N26-G14KH-K的抗癌活性相较于B2Ka-N26-G14K提高了 4-5倍,说明赖氨酸相比于组氨酸有利于提高抗癌活性。在以上工作的基础上,我们又进一步研究了抗菌肽对细菌的作用机制,原子力显微镜及细菌毒性检测结果证明:抗菌肽作用机制不同于传统抗生素,抗菌肽能使细胞膜受到破坏,致使细胞裂解,从而起到杀菌作用。本课题首次以Brevinin-2家族抗菌肽作为模板,设计合成一系列类似物,研究了该家族的构效关系,并获得具有应用前景的抗菌肽。本研究为抗菌肽分子改造、开发新型抗菌制剂奠定了基础。