种子细胞来源问题已成为限制软骨组织工程进一步发展和临床应用的主要“瓶颈”问题。研究证实，骨髓间充质干细胞(BMSCs)在特定培养条件下可定向诱导分化为软骨，但将诱导的BMSCs与可降解生物材料复合植入动物体内后，发现几乎无软骨组织形成，可能因为在BMSCs定向分化为软骨细胞过程中，诱导因子尤其是hTGF-b1起了非常关键的作用，而当将经诱导的BMSCs植入体内后，由于失去体外特定培养液中的高浓度的hTGF-b1的诱导作用，大部分经诱导的BMSCs可能会“反分化”而不再分泌软骨细胞特异性基质，最终几乎不能形成软骨组织。本实验利用基因工程方法将主要诱导因子基因TGF-b1转入BMSCs，使外源基因在一定时期内能高效表达，植入体内后能通过自分泌或旁分泌途径来表达目的诱导因子，进一步促进其分化和维持表型稳定，从而弥补由于突然失去体外特定培养液中的高浓度hTGF-b1的诱导作用而可能发生的“反分化”。本实验旨在探讨如下四部分问题： 1．携带人转化生长因子β1的腺病毒载体的构建及鉴定 方法:应用基因重组技术构建重组hTGF-b1腺病毒表达载体，分别用限制性内切酶和聚合酶链反应(PCR)鉴定,并通过脂质体Fugene6介导腺病毒DNA转染293细胞。 结果:重组hTGF-b1腺病毒DNA经限制性内切酶XhoI酶切后，得到14.5Kb、8.1 Kb、4.2 Kb、4.0 Kb、2.5 Kb、1.4 Kb、0.6 Kb片段，经PI-SceI/I-CeuI双酶切后，得到32.6 Kb片段和2.6 Kb含目的基因的片段，片段大小无误，表明重组hTGF-b1腺病毒(adeno-hTGF-b1)表达系统构建成功。以重组adeno-hTGF-b1 DNA为模板的PCR产物中出现1.35kb hTGF-b1目的基因片段，表明hTGF-b1基因成功连接至adeno-X腺病毒表达载体中。重组hTGF-b1 腺病毒表达载体通过Fugene 6 介导转染293 包装细胞，出现细胞病变效应(CPE)。采用PCR反应鉴定293细胞包装的腺病毒，扩增出247bp的 hTGF-b1目的基因片断和312 bp腺病毒骨架基因片断。 2．重组hTGF-b1腺病毒转染骨髓间充质干细胞功能表达的鉴定 方法:重组hTGF-b1腺病毒转染第一代猪BMSCs，转染后以RT-PCR检测重组腺病毒转染后hTGF-b1 mRNA表达，免疫细胞化学定性和酶联免疫吸附(ELISA)定量检测重组腺病毒转染hTGF-b1蛋白的表达，水貂肺上皮细胞(Mu1lV )生长抑制实验检测表达的hTGF-b1生物学活性。 结果:adeno-hTGF-b1转染BMSCs有hTGF-b1 mRNA的有效表达，免疫细胞化学证实重组腺病毒转染后BMSCs胞浆内有大量棕黄色的hTGF-b1蛋白表达，ELISA结果提示adeno-hTGF-b1转染的BMSCs,其hTGF-β1表达量是转染adeno-lacZ 的BMSCs 2.65倍，差异有显著性,Mu1Lv细胞生长抑制率测定证实BMSCs分泌hTGF-b1蛋白有生物学活性。 3. 重组hTGF-b1腺病毒转染BMSCs对其向软骨分化的影响 方法:重组adeno-hTGF-b1转染第一代猪BMSCs，对照组转染adeno-LacZ，腺病毒的量以200pfu/细胞计算，转染后1天，消化收集重组腺病毒转染后的BMSCs，置于无菌15ml聚丙烯试管中，体外细胞团聚集连续诱导培养21d，然后分别从大体观察、组织学和II型胶原蛋白免疫组化的检测对形成组织进行评价。 结果:实验组HE染色观察可见细胞团外周为由数层扁平状成纤维样细胞组成的纤维软骨膜，下层和中部区域有巢状软骨形成，软骨陷窝明显可见，软骨细胞较均匀分布，包埋在软骨陷窝内。Safranin’O染色显示，形成的软骨组织区域有大量被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示细胞团中央出现较明显的阳性染色区域，可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内。对照组HE染色观察见无软骨样组织形成，主要为较致密无结构特征的纤维样组织，Safranin’O染色也未见被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示无明显的阳性染色区。 4．重组hTGF-b1腺病毒转染的BMSCs在裸鼠体内成软骨能力初步研究 方法:重组adeno-hTGF-b1转染第一代猪BMSCs，对照组转染adeno-LacZ，腺病毒的量以200pfu/细胞计算，转染后1天，消化收集重组腺病毒转染后的BMSCs，以浓度为5×107/ml细胞悬液均匀接种于圆盘状PGA支架上，体外连续诱导培养10d, 然后植入裸鼠背部皮下,在植入后第4周取材，分别行大体观察、组织学和II型胶原免疫组化检测对形成组织进行评价。 结果:实验组 HE染色观察到形成的软骨区域有较清楚的软骨陷窝，软骨细胞分布较均匀，包埋在软骨陷窝内，部分区域可见较多的纤维组织和少量的骨组织，对照组HE染色观察到有些区域也有软骨形成，但可见较多的纤维组织和少量的骨组织，应用图象分析软件定量分析实验组和对照组形成软骨占总组织百分比，分别为41.83±4.64（％）和17.50±2.85（％），差异有显著性。Safranin’O染色显示，实验组和对照组形成的软骨组织区域都有被染成桔红色蛋白多糖类基质分泌，Ⅱ型胶原免疫组化染色检测形成的软骨组织区域也有较明显的阳性染色区域，可见棕黄色的颗粒分布于胞浆内。 结论： 1．已成功构建携带人 hTGF-b1重组腺病毒载体，并能在293细胞包装和扩增。 2．重组hTGF-b1腺病毒能够被导入BMSCs，并表达有生物学活性hTGF-b1蛋白。 3．应用重组hTGF-b1腺病毒转染的BMSCs进行细胞团聚集诱导培养，至少可诱导部分BMSCs向软骨细胞表型分化而形成软骨。 4．重组hTGF-b1腺病毒转染BMSCs作为种子细胞，在裸鼠体内的一定时限内能促使软骨组织形成。 本研究有望为软骨组织工程中种子细胞来源问题的探索提供一条新的途径，为将来临床应用hTGF-b1基因转染的人BMSCs构建软骨和修复软骨缺损提供实验依据。