论文部分内容阅读
研究背景:胶质母细胞瘤（Glioblastoma,GBM）是中枢神经系统最常见、最致命的原发性肿瘤。基于最大限度的手术切除,即使靶向治疗和免疫治疗取得了进展,GBMs的预后仍然很差。由于肿瘤内分子异质性引起的复杂性,针对特定亚型或突变的靶向或定制治疗大多失败。大多数肿瘤对治疗产生耐药性并很快复发。各种各样的研究表明,在包括GBM的许多类型的癌症中都存在有一小部分未成熟、未分化的具有引发肿瘤能力的肿瘤细胞亚群。在GBM中,它们被称为胶质瘤起始细胞（glioma initiating cells,GICs）,或被称为胶质瘤干细胞样细胞,具有自我更新、永久增殖、多向分化和强烈的致瘤性,维持了 GBM患者特有的遗传和表观遗传多样性。重要的是,GICs对化疗和放疗的抵抗最终导致肿瘤复发,这表明GICs在治疗期间可以明确靶向,以减少肿瘤复发的危险。溴代结构域和末端外结构域（bromodomain and extraterminal domain,BET）家族蛋白是通过识别组蛋白和非组蛋白染色质因子上的乙酰化赖氨酸残基来管理基因表达的表观遗传读取器。BRD4是这个家族中研究最多的成员,与多种人类癌症有关。在癌症干细胞中,一些研究提到靶向BRD2和BRD4抑制GIC增殖,BRD4缺失诱导GIC凋亡。然而,BET家族蛋白参与调控GIC过程的分子机制尚不清楚。研究目的:本研究旨在探讨BET家族蛋白与GICs之间的关系,研究BET家族蛋白对GICs自我更新和致瘤性的影响并探索其中的分子机制,为靶向GICs的临床转化治疗提供新的理论依据。研究方法:1.基于TCGA和CGGA数据库中胶质瘤患者数据的生物信息学分析,评估BET家族蛋白BRD2、BRD3和BRD4的mRNA表达水平与胶质瘤患者的预后关系,并分析了不同WHO分级、病理学分型及GBM的分子亚型中BRD4的表达情况;通过Western Blot及免疫组化检测BRD4在GBM组织中的表达;2.通过CCK8、单细胞成球实验、极限稀释实验,经BET抑制剂I-BET151和shBRD2/BRD3/BRD4干扰后,检测抑制BET蛋白对GICs自我更新和致瘤性的影响,并通过Western Blot和免疫荧光染色检测干细胞相关蛋白Nestin、CD133和Sox2的表达;通过构建原位种植瘤模型,利用活体成像、小鼠生存分析、HE和免疫组化,评估I-BET151对GICs致瘤性的影响;3.通过Western Blot和免疫荧光染色检测BRD2、BRD3和BRD4抑制后Notch1信号通路相关蛋白Notch1、NICD和Hes1蛋白的表达;通过染色质免疫沉淀（CHIP）后的qPCR检测BRD4在Notch1启动子区的富集情况;qPCR检测BRD4抑制后Notch1的mRNA水平变化;基于CHIP-Seq对U251 GICs的全基因组测序后UCSC数据库的可视化处理,观察BRD4在Notch1启动子区域的富集;基于CHIP-Seq的结果,经基因富集分析和KEGG通路分析,预测BRD4参与GICs的生物学进程;4.基于过表达BRD4的GBM细胞的建立,通过CCK8、单细胞成球实验、极限稀释实验检测抑制Notch1通路后对GICs自我更新和致瘤性的影响;通过Western Blot和免疫荧光染色检测干细胞相关蛋白和Notch1通路相关蛋白的表达;通过生物信息学分析BRD4和干细胞相关蛋白、Notch1通路相关蛋白的相关性。研究结果:1.TCGA及CGGA的数据显示BRD4的mRNA表达与胶质瘤患者的总生存期密切相关,BRD4表达水平越高,提示胶质瘤患者更差的预后,BRD2和BRD3的数据并不支持这一结果;BRD4的表达在WHO Ⅳ级的GBM患者中最高,并且在GBM的经典亚型中表达也最高;基于GBM和正常组织样本检测,BRD4在GBM中的表达较正常组织明显较高。2.单细胞成球实验表明,I-BET151能有效地阻断GIC细胞球的形成;通过测量和量化U87、U251和原代细胞中细胞球的数量和大小,证明了I-BET151治疗的有效性;CCK8测定确定I-BET151降低了 GIC的增殖;在极限稀释实验中,随着I-BET151浓度的增加,非成球的细胞比例不断增加;I-BET151抑制了干细胞相关蛋白的表达;这些结果提示靶向BET蛋白抑制了 GICs的自我更新能力。进一步的shRNA干扰后数据提示,BRD4被确定是调控GIC自我更新能力的原因。在体内实验中,通过活体成像和HE染色显示,经I-BET151治疗后肿瘤体积变小,且小鼠存活时间更长;免疫组化的结果提示I-BET151治疗后,干细胞相关蛋白和Notch1通路相关蛋白表达减低。这些结果表明I-BET151抑制了 GICs的致瘤性。3.Western Blot和免疫荧光染色的结果提示,BRD4被抑制后,Notch1通路相关蛋白的表达降低,BRD2和BRD3的干扰并不影响这一结果;染色质免疫沉淀后的qPCR结果提示,抑制BRD4后,其在Notch1启动子区的富集少;qPCR的结果显示抑制BRD4降低了 Notch1的mRNA表达;CHIP-Seq数据经UCSC数据可视化处理后,显示BRD4在Notch1启动子区显著富集;通过对BRD4显著富集的基因进行GO和KEGG分析,发现BRD4与GICs的代谢进程有关。4.在BRD4过表达的细胞中,单细胞成球实验表明,抑制Notch1通路能有效地阻断GIC细胞球的形成;CCK8测定确定抑制Notch1通路降低了 GIC的增殖;在极限稀释实验中,抑制Notch1通路后,非成球的细胞比例增加;同样地,抑制Notch1通路降低了干细胞相关蛋白的表达;这些结果提示即使BRD4过表达,靶向Notch1通路仍能抑制GICs的自我更新能力。研究结论:我们的发现提出了一种新的胶质瘤治疗策略。我们的研究结果表明BRD4在Notch1的启动子区域富集,并且BRD4的抑制能够下调GIC的自我更新和致瘤性。这可能是抑制GIC的一个有希望的策略。因此,针对BRD4和调节Notch1启动子区转录的分子靶向和/或信号通路的研究需要更深入的探索,因为它们可能有助于开发治疗GBM的合适方案。