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前言 肿瘤的发生是一个复杂的生物学过程，有多种基因参与作用。随着现代细胞分子生物学理论和技术的发展，对细胞癌变以及肿瘤的形成规律有了更新的认识。认为细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞在周期时相的变迁中进人增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。 P16基因是近年发现的直接参与细胞生长增殖负调控的抑癌基因。Cyclin D1即是细胞周期素D1，是1991年被发现的，为目前公认的癌基因。P16通过与细胞周期素D1以竞争方式结合CDK4，抑制CDK4活性，使细胞停滞于G0期或G1期，而抑制细胞分裂、增殖。 外阴癌(VSCC)是妇科少见的恶性肿瘤之一，其中外阴鳞癌最常见，占外阴恶性肿瘤的80-90％。外阴上皮内瘤样病变(VIN)过去称为外阴不典型增生，近年来，发病率有逐年上升的趋势。且认为与人乳头瘤病毒感染有关。外阴非瘤样上皮病，过去称为外阴营养不良(VNNED)，视为癌前疾病，目前仅流行病学研究发现其有恶变倾向，三者在分子水平上是否存在一些相同的变化，尚不清楚。 本研究采用免疫组化方法研究细胞周期中的两个因子P16蛋白和Cyclin D1进行研究。并探讨他们与外阴癌变之间的关系。 材料与方法 1．实验对象 收集1994年1月至2003年6月在中国医科大学附属第一医院住院或门诊就诊的病例，① 外阴鳞癌组织标本30例；② 外阴上皮内瘤变标本30例，其中VIN Ⅰ 10例。VIN Ⅱ 10例。VIN Ⅲ 10例；③ 外阴上皮内非瘤样病变标本40例，其中鳞状上皮细胞增生20例。硬化性苔藓20例。④ 正常皮肤10例做对照。 获取的标本均用10%福尔马林液浸泡固定，石蜡包埋，4协m厚连续切片，常规HE染色，经两位资深的病理医师确诊。 2.实验试剂 即用型鼠抗人P16单克隆抗体，鼠抗人CyclinDI单克隆抗体，工作浓度均为1:100。SP试剂盒均购自福建迈新生物技术有限公司。 3.实验方法 3.1免疫组织化学方法(SP法) 4林m切片常规脱蜡，梯度酒精水化，3%过氧化氢的甲醇溶液中浸20分钟，以阻断内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3次，每次3分钟。高压抗原修复。PBS冲洗3次，每次5分钟。正常羊血清室温封闭20分钟，甩去多余液体。滴加一抗(即用型鼠抗人P16单克隆抗体或鼠抗人CyclinDI单克隆抗体)。4℃冰箱过夜，PBS冲洗3次，每次5分钟。加人生物素标记的二抗，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。加人SP复合物于室温下孵育20分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。DAB显色，在显微镜下观察，控制显色时间。自来水冲洗，终止显色。苏木素复染，脱水，透明，封片。以PBS液代替一抗作阴性对照。 3.2结果判定:P16蛋白和Cydin Dl表达定位于细胞核，阳性染色均为棕黄色颗粒。每张切片在高倍镜下随机选择5个高倍视野，计算各视野阳性细胞的百分数。取其平均值为细胞阳性指数(U二染色阳性细胞/肿瘤细胞数xl00%)。 3.3统计学处理:各组间比较、不同临床分期比较均以SPSS 10.0统计软件包进行统计学处理，显著性水准为P<0.05。并用x，检验。计数资料进行相关分析。结果 1.P16基因和Cyclin Dl在各组中的表达 P16蛋白表达主要定位于细胞核中，阳性细胞在正常组织中主要分布在基底细胞层。在VIN异型细胞中出现P16蛋白表达，在VNNED中基底及近基底的棘细胞层内出现P16蛋白表达，恶变的癌细胞中也有表达，但表达下降。 CychnDI表达主要分布在上皮细胞核和癌细胞核内，而在正常上皮中无表达。在VNNED中的棘细胞层中有表达，在vIN异型细胞中表达增加，在VSCC中Cyclin Dl表达明显增加，且位于癌细胞中。 2·P16基因和Cyclin Dl在各组中表达的阳性病例数 P16蛋白在正常外阴皮肤中的表达为100%(10/10)，在外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变和外阴鳞癌中的阳性病例数分别为87.5%(35风o)、83 .3%(25/30)和40.0%(12/30)。正常外阴皮肤中pl6蛋白的阳性病例数高于外阴上皮内非瘤样病变和外阴上皮内瘤样病变，但无明显差异(P>0.05)。但外阴鳞癌与正常外阴皮肤、外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变组相比均有显著差异(P<0.05)。 CyclinDI在正常外阴皮肤、外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变和外阴鳞癌中的阳性病例数分别为O%(0/10)、35.0%(14/40)、43.3%(一3/30)和63 .3%(19/30)。Cyelin Dl在正常外阴皮肤与外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变和外阴鳞癌之间比较均有显著的差异(P<0.05)。外阴鳞癌与外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变间比较也有显著差异(P<0.05)。但外阴上皮内非瘤样病变和外阴上皮内瘤样病变间比较无差异(P>0.05)。 3.P16蛋白和Cyclin Dl在各组中细胞阳性指数的比较 P16蛋白在正常外阴皮肤、外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变和外阴鳞癌中的细胞阳性指数分别为(97.5%、73.65%、66.27%和11.9%)。外阴鳞癌与正常外阴皮肤、外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变相比均有显著差异(P<0.05)。而其它三组间之间比较无差异(P>0 .05)。 CyclinDI在正常外阴皮肤、外阴上皮内非瘤样病变、外阴上皮内瘤样病变和外阴鳞