磺胺二甲基嘧啶免疫层析法的建立及应用

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磺胺二甲基嘧啶(Sulfamethazine,SMZ)是一种被广泛应用于畜牧生产的广谱抑菌型兽药,它会干扰细菌的叶酸代谢途径,进而影响细菌正常的生长繁殖。SMZ的不合理使用可能会造成其在动物源性食品中残留,并通过食物链在人体蓄积,从而危害人类的健康。因此,建立快速灵敏的检测方法对动物源性食品中SMZ残留进行监控尤为重要。近年来,免疫层析法(Lateral flow immunoassay,LFIA)由于其具有简便、快速及低成本等优点,已经被广泛应用于环境监测、疾病诊断和食品安全检测等领域。然而,以金纳米粒子(Gold nanoparticles,Au NPs)为信号标记物的传统LFIA灵敏度低且以定性检测为主,因此不能对一些低浓度的目标物进行痕量分析。目前,选择一些具有独特荧光特性或光吸收的新型纳米材料作为信号标记物是提高LFIA检测性能的一个重要途径。本研究选择了三种新型纳米材料作为标记物,构建了三种新型的LFIA,并将其应用于SMZ残留的检测中。第一章系统地介绍了目标分析物SMZ,其中包括SMZ的理化性质、危害、抑菌机理、最大残留限量及当前检测研究进展。接着对LFIA检测平台进行了概述,主要包括LFIA的结构、原理、信号标记物及加样方式。第二章建立了以时间分辨荧光微球(Time-resolved fluorescent nanobeads,TRFN)为信号标记物的LFIA,实现了对鸡蛋、蜂蜜和猪肉中SMZ残留的高灵敏检测。在最优实验条件下,TRFN-LFIA检测鸡蛋、蜂蜜和猪肉中SMZ的检测限(Limit of detection,LOD)分别为0.016、0.049和0.029ng/mL;线性范围分别为0.05-1、0.05-5和0.05-1ng/mL。回收率实验表明,该方法检测鸡蛋、蜂蜜和猪肉中SMZ的平均回收率分别为90.5%-113.9%、82.4%-112.0%和79.8%-93.4%,变异系数分别为4.1%-11.7%、7.5%-11.5%和4.8%-8.7%。此外,利用TRFN-LFIA和仪器法同时对45个实际样本进行分析,其检测结果一致,证明了所建立的方法具有良好的准确性。第三章首次建立了以聚集诱导发光荧光微球(Aggregation-induced emission fluorescent microsphere,AIEFM)为信号标记物的竞争型LFIA,实现了对蜂蜜中SMZ残留的高灵敏检测。在最佳实验条件下,本章建立的竞争型AIEFM-LFIA检测蜂蜜中SMZ残留的LOD为0.028ng/mL,线性范围为0.05-5ng/mL。回收率实验表明,本方法检测蜂蜜中SMZ的平均回收率为75.6%–95.1%,变异系数为5.7%–12.9%。此外,利用AIEFM-LFIA和仪器法同时对15个蜂蜜样本进行分析,两种方法的检测结果一致,证明了所建立的方法具有良好的准确性。第四章建立了一种基于聚多巴胺微球(Polydopamine nanospheres,PDANs)双重荧光淬灭的新型多模式信号输出的LFIA,实现了对鸡肉中SMZ残留的超灵敏检测。相较于仅具有单重淬灭能力的传统淬灭剂Au NPs而言,PDANs具有双重荧光淬灭能力,即能同时淬灭AIEFM、荧光微球(Fluorescent microsphere,FM)和量子点微球(Quantum dot bead,QB)等三种荧光供体的激发光和发射光。将这两种淬灭剂同时应用于荧光淬灭LFIA中,结果显示基于PDANs-LFIA的三种荧光变化值(ΔFAIEFM=2315,ΔFFM=979,ΔFQB=910)均大于基于Au NPs-LFIA的三种荧光变化值(ΔFAIEFM=1722,ΔFFM=833,ΔFQB=520)。这些结果证明了PDANs可以提升荧光淬灭LFIA的淬灭效率及灵敏度。在最佳条件下,基于PDANs淬灭AIEFM荧光的LFIA在检测鸡肉中SMZ的LOD和裸眼检测阈值分别能达到0.043ng/mL和0.5ng/mL。第五章对本文所建立的三种检测SMZ的LFIA进行了系统地总结,并展望了未来改进LFIA检测性能的潜在方法。
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