背景脓毒症（sepsis）是指由明确或可疑感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammation respone syndrome,SIRS）,可进一步发展,导致严重脓毒症、脓毒症休克和多器官功能障碍（multiple organ dysfunction sydrome,MODS）。心脏是脓毒症的易损靶器官之一,约50%的患者在脓毒症早期即出现心肌功能的抑制,心功能不全是脓毒症最为严重的并发症之一。脓毒症导致的心功能不全具有发病率高和死亡率高的特点,一旦发生,死亡率将由20%升高至70%-90%。目前关于脓毒症性心脏功能不全机制的研究尚未完全阐明,主要集中在级联放大的炎症反应、心肌细胞的凋亡、微循环内皮细胞功能障碍、心肌细胞能量代谢障碍等,现在也缺乏有效的预防和治疗方法。微小RNA（microRNA,miRNA）近年来成为研究的热点,是一类小分子非编码蛋白质的单链RNA,主要通过在转录后水平负性调控基因的表达而发挥作用。微小 RNA-125b（microRNA-125b,miR-125b）是首个被发现的 miRNA lin-4的同源基因,在细胞增殖、凋亡、分化以及炎症反应中都发挥重要的作用。有研究证实,核转录因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）激活后,能抑制miR-125b 的表达。另外,用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激 Raw264.7巨噬细胞后,miR-125b的表达量减少;过表达miR-125b可下调肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）水平。本课题组前期研究表明,miR-125b保护心肌缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury,I/R）主要通过抑制靶基因TRAF6的表达从而降低NF-κB活性,另一方面miR-125b还可以通过抑制靶基因p53和Bak的表达从而减少I/R导致的心肌细胞凋亡。TRAF6/NF-κB介导的炎症反应以及心肌细胞凋亡在脓毒症心功能不全中扮演重要的角色。但是miR-125b在脓毒症所致心功能不全中的作用及其机制还知之甚少,进一步的研究有助于为预防和治疗脓毒症性心功能不全提供新的策略。目的本研究将分为三部分进行,首先确定miR-125b对脓毒症所导致的小鼠心功能不全的影响,是保护性的还是破坏性的（第一部分）,然后进一步深入探讨其作用机制,分为动物实验（第二部分）和细胞实验（第三部分）两方面,重点关注炎症反应和细胞凋亡是否在其中扮演重要的角色。第一部分 MicroRNA-125b对脓毒症所致小鼠心功能不全的影响方法1.LPS刺激巨噬细胞和心肌细胞后miR-125b的表达情况检测将J774a.1巨噬细胞和H9c2心肌细胞分为未处理组（Con）和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）刺激组,用100ng/ml LPS刺激细胞 12h后,采用荧光实时定量PCR法（quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）比较两种细胞处理前后miR-125b表达量的变化。2.脓毒症小鼠心肌组织和循环血清中miR-125b的表达情况检测用盲肠结扎穿孔（cecal ligation puncture procedure,CLP）的方法建立小鼠脓毒症体内模型。分为假手术组（Sham）和手术处理组（CLP）,手术后6h收集小鼠心肌组织和血清,采用qRT-PCR法比较心肌组织和血清中miR-125b表达量的变化。3.动物处理和分组小鼠心肌过表达miR-125b的方法:微型导管从小鼠右颈总动脉插入,直至主动脉根部,朝心脏方向注射约1 × 108 IU miR-125b过表达慢病毒（lentivirus miR-125b,LmiR-125b）,注射非特异性干扰片段病毒（lentivirus miR-Con,LmiR-Con）作为阴性对照。选取10-12周龄C57BL/6J小鼠,随机分为6组:未注射慢病毒只行假手术组（Untransfected+Sham）、未注射慢病毒只行CLP手术组（Untransfected+CLP）、注射 LmiR-Con 7天后行假手术组（LmiR-Con+Sham）、注射 LmiR-Con 7 天后行 CLP 手术组（LmiR-Con+CLP）、注射 LmiR-125b 7 天后行假手术组（LmiR-125b+Sham）、注射 LmiR-125b 7 天后行 CLP 手术组（LmiR-125b+CLP）。4.小鼠心肌组织感染慢病毒效率检测通过免疫荧光方法观察慢病毒载体携带的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达情况和qRT-PCR法检测小鼠心肌组织中miR-125b的表达量。5.小鼠心功能测定CLP手术后6h,利用超声心动图评定小鼠心功能。6.小鼠生存率测定对上述 Untransfected+CLP,LmiR-Con+CLP,LmiR-125b+CLP 3 组小鼠进行 7天生存率的比较,用log-rank检验进行统计学分析。结果LPS刺激J774a.1巨噬细胞和H9c2心肌细胞后,两种细胞miR-125b的表达量均显著下降;CLP术后小鼠心肌组织和循环血清中miR-125b的表达量也明显下降,表明miR-125b参与调控脓毒症发展过程。用CLP手术建立小鼠脓毒症体内模型,超声心动图结果表明CLP手术后罹患脓毒症小鼠的心功能显著下降,利用miR-125b过表达慢病毒感染小鼠心肌组织后,发现脓毒症所导致的小鼠心功能不全得到改善。与感染LmiR-Con的CLP小鼠相比,过表达miR-125b的 CLP 小鼠 EF%、FS%、SV 和 CO 分别提高了 32.6%、43%、71.4%和 75.9%（P<0.01）。过表达miR-125b可以明显提高CLP诱导的脓毒症小鼠的生存率。感染LmiR-Con与未感染病毒组相比,CLP小鼠心功能和生存率没有明显改变。结论1.CLP诱导的脓毒症小鼠血清和心肌组织中miR-125b的表达量下降。2.过表达miR-125b可以改善脓毒症所导致的小鼠心功能不全。3.过表达miR-125b可以提高脓毒症小鼠的生存率。第二部分 MicroRNA-125b保护脓毒症所致心功能不全的机制研究（体内实验）方法1.小鼠循环血清中炎症因子的测定通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定小鼠血清中TNF-α,IL-1β的水平。2.小鼠心肌组织中炎性细胞浸润和黏附分子表达水平的检测采用免疫组织化学的方法,观察和计数小鼠心肌组织中巨噬细胞和中性粒细胞浸润的情况,利用Western Blot法检测细胞间粘附分子-1（intercelluar adhension molecule-1,ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-l,VCAM-1）的表达量。3.小鼠心肌组织NF-κB活性和TRAF6表达量的测定分别通过凝胶迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）和Western Blot法检测小鼠心肌组织中NF-κB活性和TRAF6的表达量。4.小鼠心肌细胞凋亡情况的检测采用Tunel法计数小鼠心肌细胞凋亡的情况,利用Caspase-Glo assay kit检测心肌组织Caspase-3/7和Caspase-8的活性。5.小鼠心肌组织中p53、Bak和Bax表达量的检测采用Western Blot法检测小鼠心肌组织p53、Bak和Bax的表达水平。结果CLP手术后6h,小鼠循环血清中炎性细胞因子TNF-α和IL-1β的含量明显增加,利用LmiR-125b感染小鼠心肌组织7天后再行CLP手术,术后6h小鼠循环血清中的TNF-α和IL-1β与感染LmiR-Con的CLP小鼠相比分别减少了55%和29.7%（P<0.01）。过表达miR-125b还可以明显降低CLP小鼠心肌组织中ICAM-1和VCAM-1的表达量。同时,过表达miR-125b显著减少了 CLP小鼠心脏中巨噬细胞和中性粒细胞的浸润。另外,脓毒症小鼠心肌组织NF-κB活性明显增高,而感染LmiR-125b后,脓毒症小鼠心肌NF-κB活性与感染LmiR-Con的脓毒症小鼠相比下降了 27.1%（P<0.01）。过表达miR-125b也能下调小鼠心肌组织TRAF6蛋白表达量。与LmiR-Con+CLP组相比,LmiR-125b+CLP 组小鼠心肌 TRAF6 表达降低了 35.5%（P<0.01）;与LmiR-Con+Sham组相比,miR-125b+Sham组小鼠心肌TRAF6表达下降了39.5%（P<0.01）。CLP使小鼠心肌细胞凋亡数目增加了 5.7倍（P<0.01）,过表达miR-125b能显著减少CLP小鼠的心肌细胞凋亡。此外,研究结果表明CLP后6h,小鼠心肌组织中Caspase-3/7和Caspase8较假手术组相比有显著增加,过表达 miR-125b 使 CLP 小鼠 Caspase-3/7 和 Caspase8 分别降低了 26.1%（P<0.05）和23.2%（P<0.01）。另外,过表达miR-125b能够显著抑制脓毒症后心肌组织中促凋亡基因p53、Bak和Bax的表达增加。结论1.抑制过度的炎症反应是miR-125b保护小鼠脓毒症心功能不全的机制之一,至少部分是通过抑制心肌组织中TRAF6的表达,从而降低NF-κB活性来实现的。2.减少心肌细胞凋亡是miR-125b保护小鼠脓毒症心功能不全的另一个重要机制,至少部分是通过减少靶蛋白p53介导的心肌细胞凋亡来实现的。第三部分 MicroRNA-125b保护脓毒症所致心功能不全的机制研究（体外实验）方法1.miR-125b mimics转染内皮细胞向人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）转染化学合成的miR-125b mimics使内皮细胞过表达miR-125b。2.细胞处理和分组用100ng/ml LPS刺激HUVECs 12h构建脓毒症体外模型。分为6组:未转染 mimics 也未用 LPS 刺激组（Untransfected+Con）、未转染 mimics 只用 LPS刺激组（Untransfected+LPS）、转染 miR-Con mimics 48h 后未用 LPS 刺激组（miR-Con+Con）、转染 miR-Con mimics 48h 后用 LPS 刺激组（miR-Con+LPS）、转染 miR-125b mimics 48h 后未用 LPS 刺激组（miR-125b+Con）、转染 miR-125b mimics 48h 后用 LPS 刺激组（miR-125b+LPS）。3.内皮细胞释放炎性细胞因子水平的测定通过Elisa法测定内皮细胞培养上清中TNF-α,IL-1β,IL-6的水平。4.内皮细胞中黏附分子表达量的测定通过Western Blot法检测内皮细胞中ICAM-1和VCAM-1的表达水平。5.内皮细胞NF-κB活性和TRAF6表达量的测定分别通过EMSA法和Western Blot法检测内皮细胞中NF-κB活性和TRAF6的表达量。结果LPS刺激内皮细胞12h后,内皮细胞培养上清中炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6含量以及内皮细胞中黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达量明显增加。然而,与转染miR-Con mimics的LPS刺激组相比,转染miR-125b mimics后的LPS刺激组细胞培养上清中TNF-α,IL-6的含量分别下降44.8%和13%（P<0.01）,IL-1β含量无明显变化。转染miR-125b mimics后的LPS刺激组与转染miR-Con mimics后的LPS刺激组相比,内皮细胞中黏附分子ICAM-1和VCAM-1的表达量分别下降21.3%（P<0.05）和27.4%（P<0.01）。另外,过表达miR-125b可以显著降低LPS诱导的内皮细胞NF-κB活性增加。转染miR-125b mimics后,无论是LPS未刺激组还是LPS刺激组内皮细胞中TRAF6表达量均显著下降。miR-125b+Con组和miR-Con+Con相比,TRAF6表达量降低了 22%（P<0.05）,同样 miR-125b+LPS 组和 miR-Con+LPS 组相比,TRAF6表达量降低了 23.9%（P<0.05）。结论1.过表达miR-125b可以抑制LPS诱导的内皮细胞炎症反应。2.减轻内皮细胞炎症反应,从而保护内皮细胞功能障碍是miR-125b保护小鼠脓毒症心功能不全的另一个重要机制,至少部分是通过抑制内皮细胞TRAF6的表达,从而降低NF-κB活性来实现的。