大豆花叶病毒重组型分离物的鉴定及抗大豆花叶病毒基因的定位及功能分析

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大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus, SMV)病是全球大豆产区分布最广的病毒病害之一,在我国各大豆产区均有发生,严重影响大豆的产量与品质。SMV是单链正义RNA病毒,具有高变异特性,在SMV与其它种类病毒复合侵染大豆时易发生病毒间的重组,形成新的病毒类型。及时了解和明确新类型病毒的信息,监控病毒的动态变化,评估其可能造成的危害,建立其预警体系,对预防新型病毒的大面积流行有着重要的作用。培育和种植抗病品种是防治病毒病害最经济、安全、有效的途径,而抗病育种的关健是具备优质抗源,阐明大豆对SMV的抗性遗传规律,对抗性基因进行标记定位,明确抗病基因作用的机理。因此,本研究的目的是监控我国大豆产区SMV株系的动态变化,对新发现的SMV病毒类型进行系统鉴定和危害评估,为该病毒的防控提供必要信息;开展大豆抗性遗传和抗性基因的分子标记定位研究,研究抗病基因的作用机制,探讨解决国内外在大豆抗SMV“一因一效”和“一因多效”的争论;利用实时荧光定量PCR技术对抗病基因目标区段的候选基因进行定量表达分析,确定大豆抗SMV的相关基因,为大豆抗病基因的图位克隆和利用转基因技术提高大豆的抗病性奠定基础。主要研究结果如下.1.大豆花叶病毒新类型的发现和鉴定对150个来源于不同省市的分离物和病样进行分析时发现了一种新类型的SMV病毒分离物(编号4469-4)。对其进行全序列测定后发现,该分离物由9994个核苷酸组成,包含一个开放阅读框(Open Reading Frame, ORF),与已报道的SMV基因组相比在5‘端多出405或406个核苷酸,翻译后形成一个由3202个氨基酸组成的多聚蛋白,蛋白切割位点与已报道的SMV分离物一致。此外,4469-4的5’UTR区域与BCMV同源性最高;P1区域在核苷酸和氨基酸水平上与WMV同源性最高,除两个区域以外,其它区域在氨基酸及核苷酸序列上均与SMV同源性最高。对5’U+P1+HC-Pro编码区段进行重组检测,结果显示,在大约在第770个核苷酸的位置检测到一个重组位点,4469-4在该位点之前与BCMV同源性最高,在该位点之后与SMV的同源性最高,表明4469-4可能由SMV与BCMV重组而来。进一步分析后发现该分离物在系统发育进化分类上与SMV有较近的亲缘关系。结果表明该分离物在分子学上应归为SMV,但鉴于其重组特性建议将其命名为SMV-R类型SMV分离物。新类型SMV分离物4469-4与SMV代表株系Sc6寄主范围的鉴定结果显示,4469-4在大豆上以轻花叶为主,但在个别大豆品种上有系统坏死,Sc6侵染大豆后有轻花叶、重花叶和坏死等多种症状,4469-4能侵染绝大部分参试大豆品种;Sc6可引起菜豆,赤豆,绿豆、蚕豆和豌豆一些豆科植物的花叶症状,4469-4仅能侵染菜豆和豌豆。由此看出,两种SMV分离物的寄主范围和致病力上存在一定差异。对150个来源于不同省市的分离物和病样进行SMV类型的检测,结果表明,有27个分离物和病样是SMV-R类型病毒。除1个分离物来源于河北之外,其余分离物来源于东南沿海和中国西南诸省(市),其中大部分来源于四川,江苏,浙江以及重庆市,推测该类型病毒可能起源于长江以南地区。2.P196983对4个中国SMV株系的抗性遗传与基因定位利用来自美国的抗源P196983研究其对4个中国株系的抗性遗传方式,分析结果显示,P196983对SMV株系SC3, SC6, SC7和SC17的抗性是均由1对显性基因控制的,分别命名为RSC3, RSC6, RSC7和RSCl7。初定位结果显示,抗病基因RSC3、RSC6和RSC17位于SSR标记BARCSOYSSR131114和BARCSOYSSR131136之间,3个抗病基因与2个标记之间的遗传距离分别为0.799cM,1.209cM;1.102cM,0.580cM和1.247cM,1.096cM;抗病基因RSC7位于BARCSOYSSR131140和BARCSOYSSR131185之间,遗传距离分别为0.035cM和2.026cM。通过在F2单株中筛选重组单株进而形成重组家系,利用重组家系进一步将RSC3、RSC6和RSC17定位在标记BARCSOYSSR131128和BARCSOYSSR131136之间,将其物理位置缩小到大约345kb区间内;将RSC7定位在标记BARCSOYSSR131140和BARCSOYSSR131155之间,将其物理位置缩小在大约381kb区间内,为抗病基因的图位克隆奠定了基础。结果还显示,RSC7与RSC3、RSC6和RSC17处于不同的物理位置上,RSC3、RSC6和RSC17在所以家系中总是共分离,可能是同一个基因命名为Rsc-pm, RSC7可能是另外一个抗病基因控制对SC7的抗性命名为Rsc-ps,因此推测P196983中存在着“一因一效”和“一因多效”两种抗病机制。3.P196983对SMV抗性候选基因的qRT-PCR分析根据定位结果预测了13个抗病候选基因,并对13个候选基因进行qTR-PCR分析,发现了一个具有LRR/NB-ARC结构特征且与抗病相关的基因Glyma13g26000。
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