BTV-HbC<,3>纯化及其感染肿瘤细胞机制初探

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本文发展了一种反向免疫共沉淀分离纯化病毒的新方法,用于从培养物中分离高纯度,高活性的蓝舌病毒。用透射电镜和凝胶过滤层析检测纯化产物病毒的结构完整性和纯度;组织培养技术检测产物的生物学活性并计算纯化得率。结果表明,纯化后的病毒悬液通过凝胶过滤层析仅出现一个紫外吸收峰,其余的未见明显的吸收峰,仅表现为靠近基线的波动;将纯化前后的病毒悬液用磷钨酸负染后直接透射电镜观察,可见到完整的病毒粒子及其干净的背景;在相同条件下,纯化前的BTV-HbC3对Vero细胞的TCID50是10-6.6/ml,纯化后的病毒对Vero细胞的TCID50是10-5.7/ml;选取一定稀释度的复孔计数空斑,依据空斑计算公式求得不同稀释度下纯化前后病毒的滴度,通过比较纯化前后的病毒滴度计算该纯化方法的纯化得率,在10-3,10-4,10-5这三个稀释度下,所计算纯化得率分别为69.6%,70.8%,50.4%。 经蓝舌病毒处理过的细胞(7402细胞,Hep-3B细胞)在普通光学显微镜下即可看到明显的形态改变。细胞在接种病毒24 hr后开始收缩变圆,间隔变大,细胞轮廓增强,胞内有粗大折光颗粒;36hr后细胞逐渐脱落,漂浮,直至破碎死亡。用MTT染色方法检测蓝舌病毒对这两株肝癌细胞株的抑制活性。在10°稀释度的蓝舌病毒作用下测得这两株细胞的抑制率分别为:51.45%和77.69%。 通过PI染色检测经蓝舌病毒处理后不同时间的细胞凋亡情况,其中感染病毒后48hr的7402,Hep-3B细胞的凋亡率分别为20.1%,33.0%。通过Hoechst33258染色后进行共聚焦显微镜观察,结果在这两株细胞中均观察到典型的凋亡细胞,主要表现为凋亡细胞出现核碎裂、边聚,碎裂的细胞核呈致密浓染的颗粒状或块状荧光,与此同时,完整核膜清晰可见。
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