背景与目的放疗、化疗是治疗鼻咽癌的主要手段，早期鼻咽癌通过单纯放疗即可达到根治。晚期鼻咽癌，尽管探索了多种方式的放疗、化疗联合治疗，但是仍有部分患者出现局部复发和远处转移，这很大程度归因于癌细胞产生多药耐药性。耐药肿瘤细胞的存在，是治疗失败的主要原因，为此临床需要寻找治疗鼻咽癌的新方法，特别是针对耐药的鼻咽癌患者的治疗方法。异基因造血干细胞移植中，供者的同种反应性NK细胞能提高抗白血病的效应，最近的研究证实，同种异体的NK能有效地杀伤原代的胃癌、肾癌、肠癌和卵巢癌肿瘤细胞，为此本研究想观察同种异体的NK是否具有杀伤鼻咽癌细胞的效应。NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关。NK细胞表面的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体（inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR）与靶细胞表面特定的HLA-Ⅰ类分子结合，介导对NK细胞毒活性的抑制效应，靶细胞缺乏KIR特定的配体将激发NK细胞对其杀伤活性。NKG2D是NK细胞表面的主要活化性受体，其配体为MHC-Ⅰ类链相关分子A或B（MHC class I chain-related molecule A or B，MICA、MICB）及人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白（human cytomegalovirus glycoprotein UL16 binding proteins，ULBPs：ULBP1、ULBP2、ULBP3），NKG2D和肿瘤细胞表面的相应配体结合，介导NK细胞的杀伤效应。NKG2D配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。异基因造血干细胞移植中，当存在供者到受者方向的抑制性杀伤细胞免疫球蛋白样受体-配体错配时，供者的同种反应性NK细胞介导的抗白血病效应可以防止白血病复发。体外实验证实NK细胞能抑制慢性粒细胞白血病患者白血病CD34⁺细胞形成粒细胞巨噬细胞集落形成单位，表明NK细胞对耐药的白血病细胞和白血病克隆形成细胞具有杀伤效应。有研究证实，KIR-配体错配的NK细胞可有效地杀伤原代的胃癌、肾癌、肠癌、卵巢癌肿瘤细胞，而无KIR-配体错配的NK细胞不具有杀伤活性。基于以上研究，本研究想利用NK细胞的生物学特性，通过体内、外试验观察同种异体的NK细胞能否杀伤人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2／DDP，如果杀伤，杀伤活性是否存在差异，杀伤差异的分子基础是什么，从而为鼻咽癌的治疗探索新的方法。方法第一章人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2／DDP与亲本细胞CNE2的生物学特性差异研究比较两者光镜下形态、生长特点，体外克隆形成率的差异；流式细胞仪分析两者细胞周期分布的差异、多药耐药蛋白P-170及ABCG2表达差异；MTT法分析其耐药谱；动物实验观察两者成瘤差异。第二章人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2／DDP HLA分型及HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体表达的检测以体外培养的CNE2、CNE2／DDP细胞为靶细胞，以QIAampDNA抽提试剂提取CNE2、CNE2／DDP细胞的DNA；CNE2、CNE2／DDP细胞HLA分型采用序列特异性引物扩增法（sequence specific primer polymerase chain reproduction，PCR-SSP）。RT-PCR检测NK细胞的主要活化性受体NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达情况。流式细胞仪检测CNE2、CNE2／DDP细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达，流式细胞仪及细胞免疫组化法检测NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的表达情况。第三章同种异体NK细胞对CNE2、CNE2／DDP细胞体外杀伤试验研究5例健康者，采静脉血以复方枸椽酸盐（acid citrate dextrose buffer，ACD-B）抗凝，以QIAampDNA抽提试剂提取5例健康者外周血细胞的DNA；PCR-SSP法测定KIR基因型；流式细胞仪检测K562细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子的表达；免疫磁珠法分离纯化5例健康者的NK细胞，体外IL2培养24h，LDH释放法检测不同效靶比时，5例健康者的NK细胞对K562、CNE2、CNE2／DDP细胞的杀伤率；观察效靶比20:1时不同的NKG2D配体的单抗及HLA-Ⅰ类分子单抗对NK细胞杀伤活性的影响；观察效靶比20:1时NK细胞对CNE2、CNE2／DDP细胞体外克隆形成的影响。第四章NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2／DDP裸鼠皮下移植瘤的抑制作用磁珠分离法从3例健康人外周静脉血中分离NK细胞，体外经IL2、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）扩增。24只BALB／c裸鼠，分为4组，每组6只。CNE2对照组、CNE2／DDP对照组、CNE2+NK细胞治疗组、CNE2／DDP+NK细胞治疗组。对数生长期的CNE2、CNE2／DDP细胞，分别配制成每0.1ml含1×10⁶个肿瘤细胞的悬液，对照组裸鼠每只皮下接种1×10⁶个CNE2或CNE2／DDP细胞，治疗组裸鼠每只皮下接种1×10⁶个CNE2或CNE2／DDP细胞同时每只经尾静脉注入3×10⁷个NK细胞，观察各组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积变化、绘制肿瘤生长曲线。成瘤后3周，取裸鼠外周血，流式细胞仪检测人NK细胞，处死老鼠，取瘤块称重，计算抑瘤率，肿瘤组织常规病理检查。结果第一章人鼻咽癌多药耐药细胞CNE2／DDP与亲本细胞CNE2生物学特性差异的研究1．CNE2和CNE2／DDP形态学及生长特点：光镜下CNE2／DDP细胞呈圆形，CNE2细胞呈多边形；生长曲线显示CNE2／DDP生长相对缓慢，CNE2／DDP、CNE2细胞群体倍增时间分别为29.46 h、21.03 h。2．细胞周期分布：流式细胞仪分析细胞周期表明，CNE2／DDP、CNE2细胞G₀／G-1期比例分别为（65.77±0.81）％、（44.9±2.21）％，两者相比差异有统计学意义（t=15.337，P=0.000）；S期分别为（23.63±0.42）％、（39.67±1.27）％，两者相比差异有统计学意义（t=20.834，P=0.000）；G₂／M细胞分别为（10.93±0.25）％、（13.23±0.31）％，两者相比差异有统计学意义（t=10.065，P=0.001）。结果表明，CNE2／DDP细胞G₀／G₁期比例较CNE2细胞高，S期、G₂／M比例较CNE2细胞低。3．P-170及ABCG2的表达：流式细胞仪分析结果显示CNE2／DDP、CNE2细胞P-170表达率分别为（75.93±0.86）％、（2.83±0.40）％，两者相比差异有统计学意义（t=159.941，P=0.000）；CNE2／DDP、CNE2细胞ABCG2表达率分别为（43.37±0.42）％、（4.07±0.59）％，两者相比差异有统计学意义（t=94.700，P=0.000）。结果表明，CNE2／DDP细胞表达多药耐药相关的蛋白。4．不同药物的耐药指数测定结果：MTT法耐药谱分析结果表明，CNE2／DDP细胞对顺铂（cisplatin，DDP）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）及长春新碱（vincristine，VCR）的耐药指数分别为18.15、28.38和13.55。结果表明，CNE2／DDP细胞具有多药耐药的特点。5．平板克隆形成实验：CNE2/DDP、CNE2细胞均能在平板中形成克隆，14天时，CNE2／DDP、CNE2细胞的克隆形成率分别为（38.44±2.68）％、（26.07±2.70）％，两者相比差异有统计学意义（t=9.760，P=0.000）。结果表明，CNE2／DDP细胞克隆形成率较CNE2细胞高。6．动物成瘤实验：动物实验表明，1×10⁶CNE2／DDP、CNE2细胞皮下接种BALB／c裸鼠均成瘤，CNE2／DDP、CNE2组肿瘤出现时间分别为（17.17±1.17）d、（10.00±2.68）d，两者相比差异有统计学意义（t=5.998，P=0.000）。第二章人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2／DDP HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体的表达1．CNE2、CNE2／DDP细胞HLA基因型：PCR-SSP法检测CNE2、CNE2／DDP细胞HLA-A，B，Cw基因型为A2，24，B18，35，Cw4，7。2．RT-PCR检测CNE2、CNE2／DDP细胞NKG2D配体的表达：RT-PCR检测结果显示，CNE2、CNE2／DDP细胞均表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3。3．流式细胞仪检测CNE2、CNE2／DDP细胞HLA-Ⅰ类分子及NKG2D配体的表达：流式细胞仪检测结果表明，CNE2、CNE2／DDP细胞表面表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP2，不表达NKG2D的配体ULBP1、ULBP3。CNE2细胞表面MICA、MICB的表达比CNE2／DDP细胞高，两者相比差异均有统计学意义（t=11.304，P=0.000；t=16.200，P=0.000）。ULBP2在CNE2、CNE2／DDP细胞表面的表达差异无统计学意义（t=0.066，P=0.949）；CNE2细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达比CNE2／DDP细胞高，分别为（99.77±0.12）％、（22.40±2.61）％，两者相比差异有统计学意义（t=73.113，P=0.000）。免疫组化证实CNE2、CNE2／DDP细胞表面表达MICArMICB、ULBP2。第三章同种异体NK细胞对CNE2、CNE2／DDP细胞体外杀伤试验研究1．KIR基因型：PCR-SSP法检测结果显示，5例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、KIR3DL2。KIR3DL1、KIR3DL2与CNE2、CNE2／DDP细胞表面相应的HLA-A、B类分子间存在错配现象。2．K562细胞表面NKG2D配体和HLA-Ⅰ类分子的表达：流式细胞仪检测结果表明，K562细胞表面表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3，不表达HLA-Ⅰ类分子。3．NK细胞杀伤活性：LDH释放法检测结果显示NK细胞对K562、CNE2、CNE2／DDP细胞的杀伤活性在效靶比5:1时分别为（29.02±0.45）％、（10.50±2.17）％、（4.98±0.95）％；效靶比10:1时分别为（44.43±1.36）％、（27.68±1.47）％、（15.48±2.10）％；效靶比20:1时分别为（57.82±1.35）％、（36.99±3.13）％、（28.46±4.30）％；效靶比30:1时分别为（71.24±2.36）％、（55.00±2.20）％、（40.95±2.21）％。随效靶比增高，NK细胞对K562、CNE2、CNE2／DDP细胞的杀伤活性增强；在各效靶比时，NK细胞对K562、CNE2、CNE2／DDP细胞的杀伤活性两两比较差异均有统计学意义。效靶比20:1时，AMO-1、BMO-1、M295、M310、M551分别对K562细胞表面相应分子进行封闭，NK细胞对K562细胞的杀伤活性分别为（46.82±2.62）％、（49.26±0.98）％、（50.42±1.79）％、（50.75±1.23）％、（51.68±1.34）％，与阻断前（57.82±1.35）％相比差异均有统计学意义（P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000）；效靶比20:1时，AMO-1、BMO-1、M310、W6／32分别对CNE2细胞表面相应分子进行封闭，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为（27.07±2.87）％、（29.12±0.68）％、（27.71±3.18）％、（50.82±4.86）％，与阻断前（36.99±3.13）％相比差异均有统计学意义（P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000）；M295、M551对CNE2细胞表面相应分子进行封闭，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性分别为（36.67±3.27）％、（36.75±2.53）％，与阻断前（36.99±3.13）％相比差异均无统计学意义（P=0.875，P=0.908）；效靶比20:1时，AMO-1、BMO-1、M310、W6／32对CNE2／DDP细胞表面相应分子进行封闭，NK细胞对CNE2／DDP细胞的杀伤活性分别为（19.04±2.27）％、（20.82±2.64）％、（20.61±2.21）％、（39.21±0.79）％，与阻断前（28.46±4.30％）相比差异均有统计学意义（P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000）；M295、M551对CNE2／DDP细胞表面相应分子进行封闭，NK细胞的杀伤活性分别为（28.46±3.62）％、（28.51+4.09）％，与阻断前相比差异均无统计学意义（P=0.999，P=0.981）。结果显示：KIR-HLA、NKG2D-配体信号系统共同调节NK细胞对CNE2、CNE2／DDP细胞的杀伤，NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性较对CNE2／DDP细胞的杀伤活性增强。4．NK细胞对CNE2、CNE2／DDP细胞体外克隆抑制试验：CNE2细胞的克隆形成率为（26.07±2.70）％，NK细胞、CNE2细胞混合组克隆形成率为（22.48±1.39）％，两组相比差异有统计学意义（t=3.556，P=0.004）。CNE2／DDP细胞的克隆形成率为（38.44±2.68）％，NK细胞、CNE2／DDP细胞混合组克隆形成率为（34.52±1.84）％，两组相比差异有统计学意义（t=3.621，P=0.002）。结果表明NK细胞能抑制CNE2、CNE2／DDP细胞体外克隆形成。第四章NK细胞对人鼻咽癌细胞CNE2及其多药耐药细胞CNE2／DDPBALB／c裸鼠皮下移植瘤的抑制作用1．成瘤情况：单纯接种CNE2细胞组和CNE2+NK细胞治疗组肿瘤出现时间分别为（10.00±2.68）d、（18.80±1.64）d，两组相比差异有统计学意义（t=6.375，P=0.000）；单纯接种CNE2细胞组和CNE2+NK细胞治疗组成瘤率分别为100％（6／6）、83.33％（5／6）。单纯接种CNE2／DDP细胞组和CNE2／DDP+NK细胞治疗组肿瘤出现时间分别为（17.17±1.17）d、（24.83±1.47）d，两组相比差异有统计学意义（t=9.991，P=0.000）。结果表明，NK细胞治疗组成瘤时间明显延长。2．CNE2、CNE2／DDP细胞移植瘤的生长情况：生长曲线显示NK细胞能明显减缓CNE2、CNE2／DDP细胞BALB／c裸鼠体内移植肿瘤的生长速度。3．裸鼠外周血人NK细胞检测：成瘤后3周，眼眶取血，流式细胞仪检测人NK细胞，结果显示，治疗组裸鼠外周血可检测到人NK细胞，对照组外周血不能检测到人NK细胞的存在。4．NK细胞抑瘤率：治疗结束，治疗组瘤块较对照组瘤块明显缩小，瘤块称重结果显示，CNE2细胞组和CNE2+NK治疗组裸鼠的肿瘤重量分别为（2.22±0.09）g、（1.42±0.09）g，（t=14.475，P=0.000），NK细胞治疗组肿瘤抑制率为36.04％。CNE2／DDP细胞组和CNE2／DDP+NK治疗组裸鼠的肿瘤重量分别为（1.60±0.22）g、（1.28±0.52）g，（t=3.517，P=0.006），NK细胞治疗组肿瘤抑制率为20％，结果显示，人NK细胞能抑制CNE2、CNE2／DDP细胞BALB／c裸鼠移植瘤的生长。5．肿瘤组织病理改变：成瘤组织经HE病理切片鉴定均为低分化鳞状上皮细胞癌，细胞呈多边形，细胞核呈卵圆形或不规则形，核仁较明显，核分离相多见。CNE2+NK细胞治疗组可见角化肿瘤细胞，较多的淋巴细胞浸润和肿瘤细胞坏死；CNE2／DDP+NK细胞治疗组亦可见淋巴细胞浸润和肿瘤细胞坏死。结论1．CNE2、CNE2／DDP细胞具：有不同的生物学特性，与CNE2细胞相比，CNE2／DDP细胞具有生长缓慢，体外克隆形成率高，G₀／G₁期细胞比例高和多药耐药的特点。2．CNE2、CNE2／DDP细胞mRNA水平均表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3；两种细胞表面均表达MICA、MICB、ULBP2，均不表达ULBP1、ULBP3；CNE2细胞表面MICA、MICB、HLA-Ⅰ类分子的表达较CNE2／DDP细胞明显增强；健康个体的KIR与CNE2、CNE2／DDP细胞表面的HLA-Ⅰ类分子之间存在错配现象。3．NK细胞通过其主要活化性受体NKG2D和CNE2、CNE2／DDP细胞表面的配体MICA、MICB、ULBP2结合激活NK细胞参与杀伤CNE2、CNE2／DDP细胞；CNE2、CNE2／DDP细胞表面表达的HLA-Ⅰ类分子抑制NK细胞对其杀伤活性4．NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性较对CNE2／DDP细胞的杀伤活性高；NK细胞能抑制CNE2、CNE2／DDP细胞体外克隆形成。5．同种异体NK细胞能抑制人CNE2、CNE2／DDP细胞BALB／c裸鼠皮下移植瘤的生长。本研究的创新点1．首次发现KIR-HLA信号通路和NKG2D-配体信号通路共同参与NK细胞对CNE2、CNE2／DDP细胞的杀伤。2．首次发现耐药鼻咽癌细胞与亲本鼻咽癌细胞表面HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体表达的差异，阐明了NK细胞对耐药鼻咽癌细胞与亲本鼻咽癌细胞杀伤活性差异的分子基础。研究价值本研究使我们从新的角度认识免疫系统与耐药肿瘤细胞之间的关系，为研究提升免疫系统对耐药肿瘤细胞的杀伤效应提供了理论和实验依据。