日本血吸虫病人兽共患,危害严重。然而,目前有关血吸虫与宿主互作的机制认识仍非常有限。大量研究显示,分泌型的外泌体(exosomes)在病原体与宿主互作中发挥重要的调控作用。为此,本研究以日本血吸虫exosomes的调控功能研究为切入点,分离并鉴定日本血吸虫exosomes中的组份,研究虫源性exosomes在细胞中迁移情况和作用效应,特别是对宿主肝脏细胞和免疫细胞的影响,进一步鉴定虫源性exosomal miRNAs对宿主及虫体靶向基因的调控机制。预期研究结果将从exosomes视角揭示日本血吸虫与宿主互作的寄生调控机制,为探讨血吸虫病的防治手段提供新思路。1.日本血吸虫exosomes分离和鉴定结合透析、超滤、超速离心和商用抽提试剂盒,筛选日本血吸虫exosomes的分离和纯化方法;利用透射电镜观察exosomes的形态;运用质谱、测序以及生物信息学技术研究exosomes中的蛋白和RNA组份,分析组份的潜在功能。结果显示分离出的日本血吸虫exosomes直径大小在50-100nm。质谱结果共鉴定出403个蛋白,这些蛋白主要参与结合、催化、翻译调节等过程。Small RNA测序鉴定出了15个已知的虫源性miRNAs(cut-off reads>100),另有约1,284,966 reads (3.4%,2,540个unique small RNAs)能与宿主基因组匹配,其中包括一个宿主源性的miRNA ocu-miR-191-5p(4,548 reads),表明日本血吸虫exosomes中既包括虫源性的遗传信息也包含宿主源性的信息,其可能参与虫体发育及血吸虫致病过程。2.虫源性exosomes调控宿主肝脏功能体外,将虫源性exosomes与肝细胞共孵育,利用荧光素标记虫源性exosomes表膜蛋白,采用荧光显微技术观察虫源性exosomes的迁移情况;运用qRT-PCR技术研究共孵育后的宿主肝细胞中虫源性的exosomal miRNAs的表达情况,鉴定虫源性exosomes能否传递虫源性信息到宿主肝细胞中。结果发现,共孵育后,虫源性miRNA可以在宿主细胞中检测到,其潜在宿主靶基因表达下调,表明日本血吸虫exosomes可以被宿主肝细胞吸收,且将虫源性的miRNAs传递到肝脏细胞,调控宿主肝细胞靶基因的表达。3.虫源性exosomes介导的免疫调控效应将虫源性exosomes与巨噬细胞共孵育,荧光分别标记虫源性exosomal蛋白和RNA,荧光显微镜观察exosomal蛋白和RNA在巨噬细胞中的迁移情况：运用ELISA及qRT-PCR等技术检测宿主免疫细胞因子表达变化,结合测序技术研究共孵育后宿主细胞mRNA表达谱变化;此外,建立小鼠过敏反应模型,将虫源性的exosomes;主射进入小鼠体内,研究虫源性exsomes对小鼠免疫应答的调控作用,初步探讨虫源性exosomes介导的免疫调控效应。结果显示,虫源性exosomes可以被巨噬细胞吞噬,释放虫源性exosomal蛋白和RNA至巨噬细胞,且刺激细胞因子IL-13,TNF和IL-5的释放,调控宿主Th2型免疫应答。4.虫源性exosomal miRNA Bantam通过靶基因CLMP调控宿主TNF信号通路生物信息学方法预测虫源性exosomal miRNA Bantam在宿主中的潜在靶基因,将预测结果与exosomes共孵育后宿主细胞mRNA表达谱结果相比较,筛选潜在的靶基因,检测其在感染日本血吸虫小鼠组织中的表达,利用荧光素酶方法验证靶基因。体外转染Bantam mimics至巨噬细胞,研究Bantam对细胞增殖和凋亡的影响及其潜在调控途径。结果筛选到3个潜在宿主靶基因CLMP、FAM212B和PRTG,其在感染日本血吸虫的宿主组织中下调。转染Bantam至巨噬细胞导致细胞中CLMP表达下调,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,同时激活TNF信号通路,表明虫源性exosomal miRNA Bantam可能是通过调控其宿主靶基因CLMP介导宿主TNF信号通路诱发宿主病理损伤。5.虫源性exosomal miRNA Bantam调控虫体发育选择与虫体发育相关的exosomal miRNA Bantam,体外培养日本血吸虫,利用RNAi方法将anti-Bantam电转进入虫体内,激光共聚焦方法观察抑制Bantam后虫体形态变化,同时利用RT-PCR方法检测Bantam干扰不同时间段后,虫体Bantam靶基因表达变化,初步探讨虫源性exosomal miRNA对虫体发育的影响。结果显示,体外抑制Bantam后,虫体卵巢破裂,卵巢实质面积减少,虫体靶基因表达上升,表明exosomal miRNA Bantam及其靶基因有可能是潜在血吸虫病防治的新药靶。