【摘 要】
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目的构建以粪肠球菌为载体的铜绿假单胞菌rEfs（pGEX-LasR）疫苗,免疫小鼠评价其诱导的保护力,并初步探讨其免疫保护机制。方法1、原核表达载体的构建。PCR扩增铜绿假单胞菌Pa01株的LasR基因,通过双酶切连接法插入质粒pGEX-1λT构建原核表达质粒pGEX-LasR,然后将其电穿孔转化大肠埃希菌BL21（DE3）株,筛选阳性克隆,采用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western bl
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目的构建以粪肠球菌为载体的铜绿假单胞菌rEfs（pGEX-LasR）疫苗,免疫小鼠评价其诱导的保护力,并初步探讨其免疫保护机制。方法1、原核表达载体的构建。PCR扩增铜绿假单胞菌Pa01株的LasR基因,通过双酶切连接法插入质粒pGEX-1λT构建原核表达质粒pGEX-LasR,然后将其电穿孔转化大肠埃希菌BL21（DE3）株,筛选阳性克隆,采用IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物。2、rEfs（pGEX-LasR）疫苗的构建与鉴定。将重组质粒pGEX-LasR电穿孔转化粪肠球菌（ATCC0077株）,挑选阳性菌落经PCR和双酶切鉴定后,诱导表达并分析和鉴定表达产物。3、rEfs（pGEX-LasR）疫苗的免疫效果及机制研究。将鉴定后的疫苗口服免疫BALB/c鼠,初免后4周采用Pa01株进行滴鼻攻击。于免疫前、免疫后及攻击后采血,ELISA检测小鼠特异性抗体。攻击后2周杀鼠剖检,肺组织菌落计数检测小鼠肺细菌负荷,MTT法检测小鼠脾细胞增殖活性,FACS检测小鼠脾细胞凋亡变化以及CD4+/CD8+亚群变化;体外Pa Ag刺激培养脾细胞,PCR检测小鼠细胞因子及Fox3+表达变化。结果1、成功从Pa01株基因组扩增出717bp的LasR基因;双酶切及PCR证实重组质粒pGEX-LasR构建成功;SDS-PAGE及Western blot结果显示该重组质粒可在大肠埃希菌BL21（DE3）中表达出53k Da的GST-LasR融合蛋白,其表达效率较高可达21%。2、双酶切和PCR显示重组质粒pGEX-LasR成功转入粪肠球菌,对表达产物的鉴定显示rEfs疫苗可表达出具有免疫反应性的GST-LasR融合蛋白。3、肺细菌菌落计数结果疫苗组小鼠细菌负荷显著低于空载体组和Efs对照组（P＜0.001）;ELISA检测显示免疫后4周小鼠血清特异性IgE、IgG及其亚类（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3）升高,且在Pa01株攻击后进一步升高（均P＜0.01）;MTT法显示疫苗组小鼠脾细胞增殖活性增强（P＜0.01）;FACS检测显示疫苗组小鼠脾细胞凋亡率降低,CD4+亚群比率升高（P＜0.01）;PCR显示体外刺激培养的疫苗组小鼠脾细胞IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-17和Fox3+基因转录升高。结论成功构建了以粪肠球菌为载体表达LasR蛋白的铜绿假单胞菌rEfs疫苗,该疫苗可有效降低小鼠肺细菌负荷,诱导小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答。
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