【摘 要】
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研究背景:凋亡是细胞发生的一种程序性死亡,能被烟草提取物（cigarette smoke extract,CSE）诱发,导致急性肺损伤的发生,但具体机制尚不明确。NLRP3（nucleotide-like receptor pyrin domain-containing protein 3）炎症小体是胞内的多蛋白体复合物,参与多种急慢性呼吸系统疾病的发生发展。研究目的:本研究旨在探讨NLRP3在C
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研究背景:凋亡是细胞发生的一种程序性死亡,能被烟草提取物（cigarette smoke extract,CSE）诱发,导致急性肺损伤的发生,但具体机制尚不明确。NLRP3（nucleotide-like receptor pyrin domain-containing protein 3）炎症小体是胞内的多蛋白体复合物,参与多种急慢性呼吸系统疾病的发生发展。研究目的:本研究旨在探讨NLRP3在CSE诱导的大鼠II型肺泡上皮细胞（RLE-6TNs）凋亡中的作用机制。方法1.采用不同浓度CSE处理RLE-6TNs 24小时（hour,h）后,采用免疫印迹（western blot）技术检测凋亡执行蛋白Cleaved caspase-3的表达情况;再选取最佳浓度CSE,分别处理RLE-6TNs 0h,12h,24h,48h,使用western blot技术检测Cleaved caspase-3的表达情况。2.将RLE-6TNs分为空白对照组和2%CSE组,采用定量逆转录聚合酶链式反应（Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,q RT-PCR）和western blot技术检测NLRP3在转录及蛋白水平的表达情况;使用荧光显微镜观察CSE对细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平的影响。3.将细胞分为2%CSE组,不同浓度MCC950预处理组,western blot技术检测MCC950对CSE上调的NLRP3的影响;在空白对照组,2%CSE组,2%CSE+MCC950组三组细胞中,使用western blot技术检测MCC950对CSE上调的Cleaved caspase-3的影响;采用流氏细胞术检测MCC950对CSE诱导的细胞凋亡的影响。4.用乙酰半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）预处理2h后,加入2%CSE再处理24h,使用荧光显微镜观察NAC对CSE上调的胞内ROS水平的影响;western blot方法检测NAC对CSE上调的NLRP3、Cleaved caspase-3的影响。结果1、Western blot检测结果显示:CSE处理后的RLE-6TN细胞内凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表达升高,且其表达随着烟草提取物浓度的升高而升高,以2%CSE最为显著;Cleaved caspase-3的表达量随着CSE处理时间的延长而升高,以24h最为明显。2、Western blot及q RT-PCR检测结果显示:2%CSE在转录及蛋白水平促进细胞内NLRP3的表达;荧光显微镜结果显示:2%CSE提高胞内ROS水平。3、Western blot检测结果显示:与2%CSE组相比,不同浓度的MCC950都能降低CSE诱导升高的NLRP3的表达,且当浓度为10μM时效应最明显;MCC950降低CSE诱导升高的Cleaved caspase-3的表达;流氏细胞术检测结果显示:MCC950能降低CSE诱导的细胞凋亡率。4、荧光显微镜结果显示:NAC降低CSE诱导升高的胞内ROS水平;Western blot检测结果显示:NAC降低CSE诱导升高的NLRP3、Cleaved-caspase 3的表达。结论1、CSE以浓度及时间依赖性的方式诱导RLE-6TNs凋亡。2、ROS/NLRP3通路参与了CSE诱导的RLE-6TNs凋亡。3、抑制ROS/NLRP3信号通路能部分逆转CSE诱导的RLE-6TNs凋亡。
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