【摘 要】
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目的:缺血性脑卒中是最常见的脑血管病,具有极高的死亡率和致残率。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是来源于骨髓的多能干细胞,具有免疫调节的特性。褐藻糖胶（Fucoidin）是一种具有抗炎症和抗氧化的复合多糖。本研究利用BMSCs和褐藻糖胶联合治疗小鼠脑缺血再灌注（Middle cerebral artery occlusion,MC
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目的:缺血性脑卒中是最常见的脑血管病,具有极高的死亡率和致残率。骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是来源于骨髓的多能干细胞,具有免疫调节的特性。褐藻糖胶（Fucoidin）是一种具有抗炎症和抗氧化的复合多糖。本研究利用BMSCs和褐藻糖胶联合治疗小鼠脑缺血再灌注（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型,观察MCAO小鼠神经运动功能、梗死体积治疗后情况,以及评估对神经元及细胞凋亡的作用。方法:用Z-Longa改良线栓法建立小鼠MCAO模型。术后对小鼠进行神经功能评分,根据评分判断造模是否成功。随后将造模成功的小鼠随机分成3组,每组10只小鼠,手术组（MCAO）、BMSCs治疗组、BMSCs联合褐藻糖胶治疗组。另将大脑中动脉不插入线栓的小鼠设为空白对照,共10只,为假手术组（SHAM）。首先将原代BMSCs分离培养及进行流式和免疫荧光鉴定。将鉴定后的BMSCs进行移植和腹腔注射褐藻糖胶治疗,将BMSCs按1×10~6由小鼠尾静脉输入小鼠体内。在输入细胞前5分钟、输入细胞后24小时,褐藻糖胶按25 mg/kg腹腔注射。治疗后对小鼠进行神经运动功能测试,包括走网格实验和撕纸实验。评估治疗后小鼠的运动和感觉功能恢复情况。治疗后24小时、48小时、72小时将小鼠麻醉,取小鼠脑组织,进行（Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色,用相机拍照,计算相对梗死体积;以及在各时间段将小鼠麻醉后进行心脏灌注,制作石蜡切片,先尼氏染色,判断梗死灶。然后用荧光抗体神经元核蛋白（Neuronal nucleoprotein,Neu N）染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶末端标记法（Tunel）进行凋亡检测。结果:MCAO术后,小鼠存活率约为70%。将神经功能评分为1-3分入组。BMSCs流式鉴定CD44的表达率约为81%,免疫荧光鉴定CD29和CD44的表达量均大于80%,而CD45几乎不表达。Image J软件计算小鼠脑组织相对梗死体积表明,治疗24小时后,两治疗组和对照组相比,相对梗死体积无明显变化;治疗48小时后,两治疗组和对照组相比,相对梗死体积略有减小,但无统计学意义;治疗72小时后,BMSCs和BMSCs联合褐藻糖胶治疗组,与对照组MCAO术后相比,小鼠脑组织的相对梗死体积减小（P＜0.05）。小鼠运动神经功能评价结果,走网格实验和粘签实验提示,在术前,小鼠的网格错步率低,粘纸去除的时间短。MCAO模型治疗24小时后,错步率明显升高,粘纸去除的时间延长,两治疗组和对照组相比无明显差异;治疗48小时后,BMSCs联合褐藻糖胶治疗组错步率较前一天稍有降低,粘纸去除时间减少,但与对照组和单纯BMSCs治疗组相比,无统计学意义;在治疗72小时后,BMSCs联合褐藻糖胶治疗组的错步率与对照组和BMSCs治疗组相比,错步率下降,粘纸去除时间减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。小鼠脑组织免疫荧光神经元标志物Neu N检测提示,假手术组Neu N阳性表达量高,MCAO术后Neu N阳性明显降低。治疗24小时后,两治疗组和对照组Neu N阳性表达量无明显差别;治疗48小时后,联合治疗组和单纯BMSCs治疗组与对照组相比,Neu N阳性表达量较前一天稍有升高,但未达到统计学意义。治疗后72小时,与对照组相比,BMSCs和褐藻糖胶联合BMSCs治疗组Neu N的阳性表达量升高（P＜0.05）,且BMSCs联合褐藻糖胶治疗组较BMSCs治疗组Neu N阳性表达量增高更明显（P＜0.05）。小鼠脑组织凋亡Tunel检测,假手术组几乎很少见凋亡细胞,MCAO术后治疗24小时后,两治疗组和对照组凋亡指数高,无明显统计学意义;治疗48小时后,褐藻糖胶联合BMSCs组凋亡指数无明显改变。治疗72小时后,与对照组相比,BMSCs和BMSCs联合褐藻糖胶治疗组,凋亡率下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。BMSCs联合褐藻糖胶治疗组细胞凋亡率比单纯BMSCs治疗组下降更明显,差异有统计学意义,（P＜0.05）。结论:BMSCs联合褐藻糖胶治疗小鼠MCAO后,减小脑梗死体积和促进小鼠神经运动功能和感觉功能恢复,同时,保护损伤神经元细胞,提高神经元标记物Neu N的阳性表达数量,并且降低了细胞的凋亡指数。
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