论文部分内容阅读
ABC转运蛋白是普遍存在于原核生物和真核生物中的跨膜转运蛋白,现已证明参与植物激素、脂类、重金属及其轭合物和次生代谢物等多种物质的转运,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。细胞分裂素（Cytokinin,CTK）参与调控果实的生长发育,其在植物体内的转运也受ABC转运蛋白介导,但具体转运机制尚不清楚。ABC转运蛋白全基因组鉴定已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）和烟草（Nicotiana tabacum）等模式植物中完成,但桃（Prunus persica）中ABC转运蛋白基因家族还未被鉴定,其在植株生长和果实发育中的作用也未见报道。本论文基于已释放的桃基因组,鉴定了ABC转运蛋白基因家族成员,并利用生物信息学技术分析了各成员的系统进化关系、染色体定位、基因结构和保守基序、保守结构域和顺式作用元件以及共线性关系;以‘粉果’桃为材料,通过基因对外源细胞分裂素6-BA处理的响应情况,筛选了参与转运细胞分裂素的候选基因;最后利用体外转运实验、atabcg14突变体表型互补实验和转基因番茄对候选基因PpABCG14转运细胞分裂素功能进行了验证,研究结果为进一步解析ABC转运蛋白调控果树植株生长和果实发育的分子机制奠定了基础。主要研究结果如下:1.基于桃全基因组数据库,共鉴定出125个ABC基因家族成员。通过与模式植物拟南芥ABC基因家族的系统进化分析,将桃ABC基因家族划分为8个亚家族,分别是ABCAABCG,ABCI。其中ABCG亚家族成员居多,共有56个成员,ABCD亚家族仅有2个成员。染色体定位表明,125个ABC转运蛋白不均匀地分布在8条染色体上,3号染色体上基因家族成员最多,为24个,7号染色体上仅有10个基因。基因结构和保守基序分析表明,各个亚家族内部具有相似的基因结构和保守基序,每个ABC基因至少含有一个NBD保守域。顺式作用元件分析表明,ABC基因家族成员含有大量生长素、脱落酸、赤霉素等植物激素响应元件,可能在激素转运中发挥作用。物种内共线性分析发现4对共线性基因,均由全基因倍增而来。物种间共线性分析表明,桃与其同科植物苹果具有较高的同源性,而与水稻之间的同源性较差。2.克隆获得了Prupe.1G353300基因的全长序列,该基因编码676个氨基酸。系统进化树分析表明,该蛋白是AtABCG14和OsABCG18的同源基因,属于ABCG亚家族,命名为PpABCG14。二级结构预测发现,PpABCG14蛋白由α-螺旋,无规卷曲和β-扩展链组成,分别为43.64%,47.93%,8.43%,三级结构预测表明PpABCG14为膜蛋白,其寡肽状态为同源二聚体。保守结构域分析表明PpABCG14含有1个TMD和1个NBD,属于半分子转运蛋白。基于PpABCG14基因的全长序列,构建了过表达载体p C1300s-PpABCG14-e GFP,烟草瞬时表达实验表明,PpABCG14是质膜定位的转运蛋白,具备转运细胞分裂素的基本条件。3.时空表达模式分析表明,候选基因PpABCG14主要在根、叶、花以及果实发育初期阶段表达,在果实发育后期表达水平较低。6-BA喷施处理可显著促进单果重的增加,使果形指数显著下降,表明外源6-BA处理通过促进细胞分裂显著提高了果实重量（p＜0.05）。6-BA处理可以显著诱导PpABCG14在叶片中的表达（p＜0.05）,在经6-BA处理后7天的叶片中（DAB 110）,PpABCG14上调表达。在叶片进行6-BA处理后14天（DAB 117）,桃果实中PpABCG14表达水平显著上升（p＜0.05）。基因表达和外源激素处理结果表明,PpABCG14可能与细胞分裂素由根向或茎向至新稍和果实库组织中外运有关。因此推测PpABCG14在调控桃植株生长和果实发育过程中发挥重要作用。4.烟草体外转运实验表明,PpABCG14转化的烟草叶片中外排的细胞分裂素显著高于空载体转化的烟草叶片,包括tZ、tZR、cZR、DZR、iPA等多种类型的细胞分裂素,而ABA转运无显著差异（P＜0.05）,在钒酸钠抑制实验中,外排溶液中多种细胞分裂素（t Z、t ZR、c ZR、DZR、i PA）显著减少,而外排ABA含量未发生显著变化（P＜0.05）,表明PpABCG14蛋白具有转运细胞分裂素的功能。5.拟南芥atabcg14突变体互补实验表明,在atabcg14突变体中过表达PpABGC14基因后,转基因植株的莲座叶、株高以及角果数与野生型植株无显著差异（p＜0.05）,表型恢复为野生型,表明PpABGC14与At ABCG14具有相似的生物学功能。同时,在Micro-Tom番茄中过表达了PpABCG14基因,获得PpABCG14转基因番茄阳性植株T1代种子。上述结果表明,PpABGC14在桃细胞分裂素的转运和分配中发挥重要作用,该基因可以通过体内转运细胞分裂素调控植株的生长和果实发育。