玉米赤霉烯酮(ZEA)是由镰)刀菌产生的一种具有雌激素样作用的毒素,广泛存在于世界各地的谷类粮食中。研究表明,ZEA结构与17p-雌二醇相似,可拮抗雌激素与受体的结合和调节,影响促性腺激素释放激素(GnRH)的分泌,导致动物及人类生殖能力的下降。近年来,ZEA可导致雄性动物生殖功能障碍的现象受到人们的关注,但相关机制不明。为探明ZEA雄性生殖毒性的机理,本试验以分离大鼠原代睾丸支持细胞为材料,对ZEA在体外诱导睾丸支持细胞Fas介导的凋亡进行了研究。1.ZEA对大鼠睾丸支持细胞Fas/FasL凋亡信号通路的影响为探究ZEA对睾丸支持细胞Fas/FasL凋亡信号通路的影响,采用大鼠原代睾丸支持细胞为材料,用不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L)处理细胞24h,AnnexinV-FITC/PI双染法流式细胞术检测凋亡率;Western blot及qRT-PCR检测死亡受体通路Fas/FasL相关蛋白的表达和转录情况。用20μmol/LZEA处理细胞,于不同染毒时间(0、4、8、16h)使用Westernblot检测凋亡调控蛋白Fas、FasL、FADD、cleaved-caspase-8的表达。结果显示,与对照组相比,各染毒组细胞凋亡率呈显著或极显著升高(P<0.05或p<0.01):10、20μmoI/LZEA能极显著升高Fas、FasL转录水平(P<0.01),20μmol/LZEA能极显著的升高FADD和caspase-8的转录水平(P<0.01);5 μmol/L以上ZEA染毒组Fas、FasL、FADD、cleaved-caspase8蛋白表达均显著或极显著性升高(P<0.05或P<0.01)。随着ZEA染毒时间的增加,Fas、FasL、FADD、cleaved-caspase8、cleaved-caspase3 的表达量均显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。表明ZEA能诱导睾丸支持细胞凋亡,Fas/FasL途径参与了 ZEA诱导睾丸支持细胞的凋亡过程。2.Fas介导的信号通路在ZEA致睾丸支持细胞线粒体凋亡中的作用为探究Fas介导的信号通路在ZEA致原代大鼠睾丸支持细胞线粒体凋亡中的作用,用不同浓度的 ZEA(0、5、10、20μmol/L)、及 20μmol/LZEA 与 l0μmol/LZ-IETD-FMK(caspase-8抑制剂)单独或联合作用于原代大鼠睾丸支持细胞,染毒时间均为24h,qRT-PCR检测凋亡相关基因Bax、Bcl-2的转录水平,Western blot检测Bax、Bcl-2的蛋白表达、细胞色素C的释放和BID、caspase-9与caspase-3蛋白的活化情况,AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率及流式细胞术结合荧光探针检测线粒体膜电位(△ψm)的变化。结果显示,随ZEA浓度的升高,睾丸支持细胞促凋基因Bax的转录水平和翻译水平均呈现上升趋势,抑凋基因Bcl-2的转录水平和翻译水平均呈现下降趋势,各染毒组Bax/Bcl-2均极显著高于对照组(p<0.01);与对照组相比,各ZEA染毒组BID的活化均增强(p<0.05或p<0.01),CytC从线粒体释放到胞浆增多(P<0.05或P<0.01),caspase-9与caspase-3的活化也均增强(P<0.05或p<0.01)。与对照组组比较,caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK组细胞相关指标均差异不显著(p>0.05);与ZEA组比较,ZEA与Z-IETD-FMK联合组细胞△ψm和凋亡率极显著下降(P<0.01),BID蛋白的活化、CytC从线粒体到胞浆的释放及caspase-9和caspase-3的活化均显著或极显著降低(P<0.05或p<0.01)。表明Fas介导的信号通路激活并参与了 ZEA诱导的睾丸支持细胞线粒体凋亡的调控。3.ZEA致睾丸丸支持细胞凋亡过程中Fas/FasL和JNK信号通路之间的调控关系为研究ZEA致睾丸支持细胞凋亡过程中Fas/FasL和JNK信号通路之间的调控关系,在细胞状态稳定的情况下,不同浓度ZEA(0、5、10、20μmol/L),20μmol/LZEA分别与 2.5 μg/μL Anti-FasL、10 μmol/L Z-IETD-FMK 或 lμg/μL DAXX siRNA 单独或联合作用于睾丸支持细胞,染毒时间均为24h。Western blot检测Fas/FasL信号通路中的AnnexinV-FITC/PI 双染法检测凋亡率,FADD、cleaved-caspase-8、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、DAXX、ASK-1、JNK3、p-JNK的蛋白表达量。结果表明,与对照组比较,Anti-FasL组细胞相关指标均差异不显著(p>0.05);与ZEA处理组相比,Anti-FasL与ZEA共处理组能明显抑制睾丸支持细胞的凋亡率(P<0.05或P<0.01);蛋白FADD,caspase-8、caspase-9、caspase-3的表达量显著或极显著减弱(P<0.05或p<0.01);对照组相比,ZEA处理组中蛋白DAXX、ASK-1、JNK3/p-JNK的表达明显增强(P<0.05或p<0.01)。与对照组比较,caspase-8抑制剂Z-IETD-FMK组和DAXX siRNA组细胞相关指标均差异不显著(p>0.05);Z-IETD-FMK与ZEA共处理组与ZEA处理组相比蛋白DAXX、ASK-1、JNK3/p-JNK的表达量呈显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01);DAXXsiRNA与ZEA共处理蛋白能够明显减弱ZEA处理引起的caspase-8、caspase-3活化增强(P<0.05或P<0.01)。结果表明,ZEA致睾丸支持细胞凋亡过程中Fas/FasL和JNK信号通路之间可相互调控。结论认为,ZEA的雄性生殖毒性可能与其引起睾丸支持细胞的凋亡而影响精子的发育。ZEA能够诱导大鼠睾丸支持细胞的凋亡,并通过Fas介导的信号通路来完成。Fas介导的凋亡信号通路可直接影响睾丸支持细胞与生精细胞对精子的发育和成熟。