【摘 要】
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氧化应激与多种奶牛繁殖障碍疾病密切相关,在奶牛子宫内膜炎中,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）既可以作为炎性分子,也可以作为炎性介质参与其病理进程,因此抗氧化应激在奶牛子宫内膜炎的防治中起着重要作用,而目前的研究尚未发现有效的“替抗”疗法。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）由于其强大的生物学功能在许多疾病模型及动物临床中都有广泛的研
【基金项目】
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黑龙江省自然科学基金（LH2020C084）项目；
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氧化应激与多种奶牛繁殖障碍疾病密切相关,在奶牛子宫内膜炎中,活性氧（Reactive oxygen species,ROS）既可以作为炎性分子,也可以作为炎性介质参与其病理进程,因此抗氧化应激在奶牛子宫内膜炎的防治中起着重要作用,而目前的研究尚未发现有效的“替抗”疗法。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）由于其强大的生物学功能在许多疾病模型及动物临床中都有广泛的研究及应用。由于奶牛子宫内膜上皮细胞（Bovine endometrial epithelial cells,BEECs）是奶牛子宫先天免疫的重要部分,因此本试验通过使用H2O2构建BEECs氧化应激模型,并探讨奶牛脂肪间充质干细胞（Bovine adipose-derived mesenchymal stem cells,b AD-MSCs）在BEECs氧化应激模型中的作用,旨在为临床上奶牛子宫内膜炎的防治提供新的思路。试验1:使用浓度为0、5、25、50、100和200μmol/L的H2O2分别处理BEECs 2、4、6、8及12 h后,通过MTT试验检测细胞存活率、流式细胞术检测细胞内ROS水平来筛选H2O2诱导BEECs氧化应激模型的最佳条件,随后通过在细胞划痕试验后使用孔径为0.4μm的transwell构建共培养体系,分析细胞迁移能力及Erk蛋白的表达水平。试验结果显示,H2O2浓度为50μmol/L时细胞存活率在50%～80%之间,当使用50μmol/L的H2O2刺激2 h时,ROS水平显著升高,H2O2的处理使BEECs的迁移能力及细胞内p Erk的蛋白表达水平显著下降（P＜0.05）,而b AD-MSCs共培养组BEECs的迁移能力与p Erk的蛋白表达水平都显著增强（P＜0.05）。试验2:在构建BEECs氧化应激模型后,使用孔径为0.4μm的transwell构建共培养体系,通过流式细胞术检测ROS水平;利用q PCR检测Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px的m RNA表达水平;采用Western blotting检测细胞内Nrf2、HO-1以及NQO1的蛋白表达水平。结果显示,b AD-MSCs的共培养可以使BEECs氧化应激模型中ROS水平显著下调,而使Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px的m RNA表达水平上调,同时,Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达水平也显著增加（P＜0.05）。试验3:在构建BEECs氧化应激模型后,使用孔径为0.4μm的transwell构建共培养体系,通过流式细胞术检测细胞凋亡情况;利用Western blotting检测Bax、Bcl2和Bcl-xl的蛋白表达水平以及NF-κB p65与p38等凋亡相关通路蛋白的表达水平。结果显示,b AD-MSCs的共培养可以显著抑制H2O2引起的细胞凋亡（P＜0.05）,显著下调Bax、NF-κB p65、p-NF-κB p65与p-p38的蛋白表达水平（P＜0.05）,并上调Bcl2和Bcl-xl的蛋白表达水平（P＜0.05）。以上试验结果显示了50μmol/L的H2O2作用2 h是构建BEECs氧化应激模型的最佳条件,表明了b AD-MSCs通过上调p Erk的蛋白表达促进氧化应激状态下BEECs的迁移;阐明了b AD-MSCs通过上调Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT和GSH-Px的m RNA表达及Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达进而抑制BEECs氧化应激模型中ROS的产生,b AD-MSCs通过下调NF-κB p65、p-NF-κB p65和p-p38的表达来促进Bcl2和Bcl-xl的蛋白表达并抑制Bax的蛋白表达,进而抑制细胞凋亡。为奶牛子宫内膜炎的“替抗”疗法奠定了理论基础。
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