【摘 要】
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【研究背景】肿瘤干细胞是肿瘤细胞的一个亚群,又称肿瘤起始细胞,在包括血癌和实体瘤在内的大多数癌症中均有发现。到目前为止,几乎所有的实体瘤都能分离到肿瘤干细胞。肿瘤干细胞具有自我更新、维持干细胞特性和分化为多种类型癌细胞的能力,在肿瘤发生过程中、治疗耐药以及治疗后的复发中发挥着重要作用。目前普遍认为肿瘤干细胞的生物学来源是突变的成体干细胞或去分化的癌细胞。此外,上皮间充质转化（EMT）以及其反向过程
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【研究背景】肿瘤干细胞是肿瘤细胞的一个亚群,又称肿瘤起始细胞,在包括血癌和实体瘤在内的大多数癌症中均有发现。到目前为止,几乎所有的实体瘤都能分离到肿瘤干细胞。肿瘤干细胞具有自我更新、维持干细胞特性和分化为多种类型癌细胞的能力,在肿瘤发生过程中、治疗耐药以及治疗后的复发中发挥着重要作用。目前普遍认为肿瘤干细胞的生物学来源是突变的成体干细胞或去分化的癌细胞。此外,上皮间充质转化（EMT）以及其反向过程（MET）是肿瘤干细胞重要来源的观点已经在乳腺癌等多种癌症中被证实。PTPN11是一种原癌基因,由它编码的SHP2蛋白普遍分布于人体组织。SHP2包含两个SH2结构域（N-SH2和C-SH2）和一个蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）结构域,PTP结构域与N-SH2结构域相互作时SHP2维持自抑制构象,当PTP结构域暴露时SHP2获得催化活性。SHP2在人类正常发育和癌症的发生发展中都有着重要作用,通过参与细胞信号转导来调节细胞的增殖、分化、凋亡和存活。SHP2异常表达或者突变与人类发育障碍、白血病和实体肿瘤密切相关。有观点认为,SHP2是通过促进肿瘤干细胞的扩增而促进实体癌的进展,但是关于其中的具体机制还不是很清楚。值得注意的是,目前的研究已经表明SHP2在前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、胶质瘤等肿瘤中可以诱导或者促进上皮间充质转化。间充质干细胞是一种典型的成体干细胞,在我们实验室的前期研究中发现,表达激活突变Ptpn11的间充质干细胞相可以在体内成瘤,而野生型的间充质干细胞却不具备成瘤能力。基于上述背景,我们对于激活突变Ptpn11的间充质干细胞充满了好奇,我们猜想Ptpn11激活突变的间充质干细胞是通过转化成肿瘤干细胞从而获得成瘤能力。为了验证我们的猜想以及探究其中的机制,我们从MX1-cre/Ptpn11+/+和MX1-cre/Ptpn11E76K/+小鼠中分离出原代MSC并且通过体外功能实验、体内成瘤实验以及一系列标志物的检测去探索表达激活突变Ptpn11的间充质干细胞是否发生转化成肿瘤干细胞以及其机制。【研究方法】1.通过MX1-cre工具鼠与Ptpn11E76K-neo/+小鼠杂交产生MX1-cre/Ptpn11+/+和MX1-cre/Ptpn11E76K/+小鼠,并且通过腹腔注射PI-PC诱导Cre酶在骨髓间充质干细胞中特异性表达从而在小鼠体内诱导骨髓间充质干细胞Ptpn11-E76K激活突变,再通过体外分离原代间充质干细胞得到我们所需要的MX1-cre/Ptpn11+/+（野生型）MX1-cre/Ptpn11E76K/+（Ptpn11激活突变）间充质干细胞。2.对原代野生型和Ptpn11激活突变间充质干细胞体外连续传代培养,观察细胞生长状态并且通过检测细胞增殖相关Ki67和衰老相关β-半乳糖甘酶比较细胞行为学差异;进一步通过体外成瘤实验比较两种细胞恶性程度以及同种细胞不同代数时成瘤能力的差异。3.在体外通过免疫荧光、Western blot、流式细胞术等实验检测野生型和Ptpn11激活突变间充质干细胞干性标志物的表达差异,在体内通过系列移植实验验证肿瘤干细胞群体是否存在存在。4.通过蛋白质组学差异分析,寻找能特异性描述肿瘤干细胞群的生物标志物,并通过流式细胞分选出特异的细胞亚群,通过肿瘤微球培养检验该亚群是否是肿瘤干细胞。5.通过对间质以及上皮细胞特异性标志物的检测以及抑制SHP2开放构象前后肿瘤干细胞亚群的变化等来探寻其机制。【研究结果】1.野生型间充质干细胞随着传代逐渐衰老死亡,而Ptpn11E76K/+激活突变使得间充质干细胞逃避衰老,并且随着连续传代培养其增殖活力逐渐增加,体内成瘤能力也逐渐增加。2.Ptpn11E76K/+间充质干细胞中肿瘤干细胞生物标志物逐渐上调以及系列移植实验都证实肿瘤干细胞亚群的存在。3.通过蛋白质组学差异分析确定可能的肿瘤干细胞生物标志物PDPN,流式细胞术分选出的PDPN阳性亚群可以在无血清的条件下形成肿瘤球,证实了这一亚群是真正的肿瘤干细胞。4.关于机制部分,对上皮及间质细胞标志物的检测以及比较抑制SHP2开放构象前后上皮细胞标志物的表达、PDPN阳性亚群的比例,可以得出Ptpn11E76K/+激活突变促进间充质干细胞发生“部分间充质上皮转化”从而转化成肿瘤干细胞。【结论】Ptpn11E76K/+激活突变促进间充质干细胞发生“部分间充质上皮转化”,转化成同时具备上皮特性以及间质特性的中间表型,即PDPN阳性肿瘤干细胞。
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