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囊尾蚴病(Cysticereosis)是由猪带绦虫(Taenia solium)的中绦期幼虫-猪囊尾蚴寄生于人或猪等中间宿主而引起的人畜共患寄生虫病。该病呈全球性分布,主要流行于经济发展相对滞后的地区,引发不同程度的公共卫生问题,危害人体健康,障碍养猪业的发展,因而成为公认的社会政治经济病。我国对猪囊尾蚴病的防控以往主要依靠药物驱虫治疗和加强公共卫生管理。但囊尾蚴病在部分地区不仅没有得到有效的遏制,反而有上升趋势。对猪囊尾蚴病高剂量的药物治疗虽然有效,但会造成药物在肉品中的残留,无助于改善肉品质量。基于我国的国情和人文环境,若想更有效的控制人、猪囊尾蚴病,必须寻求以免疫预防为主的综合防控措施。常规技术研制的疫苗虽然有效,但抗原来源受到限制,不可能规模化生产。只有利用基因工程技术开发新型疫苗,才有可能使囊尾蚴病的免疫预防成为现实。本研究利用RT-PCR等方法从孵化激活的猪带绦虫六钩蚴与囊尾蚴中克隆了45W基因家族、TSOL18基因和B抗原基因,采用生物信息学的方法分析了部分基因的结构特征及其编码蛋白的特性,在此基础上选择原核和真核表达系统进行了高效表达,评价了三种抗原的免疫原性。
1.利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从激活的猪带绦虫六钩蚴克隆到45W基因家族。测序及DNAstar软件分析证实,得到八个A型转录本、三个相应的B型转录本和四个其它B型转录本,以及一个C型转录本,推测45W基因家族至少有12个成员,而不是如国外学者所认为的4个。猪带绦虫45W A3和B2蛋白可能是跨膜糖蛋白,跨膜区位于C末端,在它的结构中可能还存在FnⅢ组件。45W蛋白可能有磷酸化修饰的加工过程。由此推测,45W基因家族成员可能有调节基因的表达、维持正常的细胞形态等多种功能,并且不一定所有的45W相关蛋白都参与机体的免疫应答过程。构建了表达载体pGEX-4BX,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达产物为分子量40ku的GST-4BX融合蛋白,其中45W-4BX的分子量为12ku,与推测的分子量大小一致。在37℃、1mmol/L IPTG诱导表达条件下,目的蛋白表达量占菌体总蛋白量的35％,主要以可溶性形式存在,也有一定量的包涵体。免疫印迹结果表明,45W-4BX表达产物与人囊虫病患者血清强烈反应,具有很好的反应原性。表达蛋白经GST Sepharose亲和层析柱纯化后,制备重组抗原疫苗进行猪免疫保护性研究。实验分五组：第一组为非免疫感染对照组；第二组为GST+206佐剂对照组；第三组为45W-4BX+206佐剂组；第四组为45W-4BX/pcDNA3-IL4组；第五组为囊尾蚴粗制抗原+206佐剂组。其中,粗制抗原的免疫剂量为1.2mg/头份；45W-4BX抗原的免疫剂量为0.3mg/头份；pcDNA3-IL4的剂量为200μg/头份；第二～五组在第一次免疫后21d进行二免,二免后一周对全部实验猪进行攻击感染,每头猪25000枚虫卵.结果表明,与非免疫感染对照组相比,GST对照组的减虫率为零,粗制抗原疫苗免疫组减虫率为92％,45W-4BX重组抗原疫苗免疫组减虫率为94％,45W-4BX/pcDNA3-IL4重组抗原疫苗组减虫率为97.5％。显示pcDNA3-IL4具有一定的免疫增强作用。
2.通过RT-PCR从孵化和激活的六钧蚴中获得TSOL18基因,测序结果与已报道的猪带绦虫美洲株TSOL18的同源性为99.5％,氨基酸的同源性为98.5％,两者间仅有2个碱基和氨基酸的差异,说明TSOL18基因在不同种株间相对保守。构建了真核表达载体pPIC9K-TSOL18,在毕赤酵母中以分泌的方式表达猪带绦虫TSOL18基因,利用SDS-PAGE、Western blot和糖苷内切酶H(Endo-H)分析目的蛋白的表达水平、特征及其生物活性。结果表明：诱导表达的培养上清中具有反应活性的重组蛋白,大小为12ku和16ku(糖基化蛋白),占培养上清蛋白总量的80％以上；在5升生物反应器中,通过优化表达条件,重组蛋白的表达量高达2.54g/L;目的蛋白进行了适度的糖基化修饰,与理论分析相符。以pcDNA3-IFN-γ、pcDNA3-IL4和pUC18-CpG作为分子免疫增强剂、以206为佐剂分别制备了TSOL18重组抗原疫苗,进行猪体免疫原性评价,共进行两个实验。实验一,有六个处理:A.非免疫感染对照组；B.粗抗原+206免疫对照组；C.TSOL18重组抗原+206佐剂组；D.TSOL18重组抗原+206佐剂+pcDNA3-IFN-γ组:E.TSOL18重组抗原+206佐剂+pcDNA3-IL4组；F.TSOL18重组抗原+206佐剂+pcDNA3-CpG组。实验二,有三个处理:A.非免疫感染对照组；B.粗抗原+206佐剂免疫组；C.TSOL18重组抗原+206佐剂组。实验二中重组抗原的免疫剂量由实验一的200μg/头份提高到400μg/头份。实验结果表明：在实验一中,pcDNA3-IL4和pUC18-CpG作为免疫增强剂,虽然明显增强了免疫动物的抗体水平,但没有明显增强免疫保护作用,两组减虫率分别为68.7％和67％,而以pcDNA3-IFN-γ
作为免疫增强剂的实验组中,虽然猪的抗体水平没有明显升高,但淋巴细胞的增殖较免疫前提高了近1.7倍,疫苗组的减虫率达到了91％,在抗原剂量仅为常规疫苗1/6的情况下,免疫效果与常规疫苗组相当。在实验二中,粗抗原+206佐剂组的减虫率为89％,TSOL18重组抗原+206佐剂组的减虫率为94％。上述结果提示,IFN-γ有可能成为猪带绦虫TSOL18重组疫苗良好的分子免疫佐剂；毕赤酵母表达的猪带绦虫TSOL18抗原具有与天然蛋白近似的免疫原性,可诱导高水平的免疫应答。
3.从猪带绦虫囊尾蚴中提取总RNA,利用RT-PCR及重叠延伸PCR法,扩增到2.6kb的AgB基因完整序列,测序证明所克隆的AgB基因的核苷酸序列与同源参考序列的同源性为99.7％。将AgB基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE检测,表达产物为121ku的GST-AgB融合蛋白,其中AgB蛋白的分子量为95ku,与报道的蛋白大小相符。目的蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总蛋白的28％,表达产物能被猪囊虫阳性血清所识别。通过对包涵体的洗涤、纯化及变复性等处理获得了蛋白浓度为3mg/mL、纯度>90％的纯化目的蛋白。用纯化的重组AgB按50μg/只、间隔两周、三次免疫8只小鼠,同时设阴性和猪囊尾蚴粗抗原作为对照,最后一次免疫后一周采血分离血清,用重组抗原作为包被抗原检测了27份猪囊尾蚴阳性血清,符合率为100％,8份健康猪血清均为阴性。将AgB基因克隆至pcDNA3.1,构建了pcDNA3-B DNA疫苗,进行猪体免疫原性评价。实验共有4个处理：非免疫感染对照组；pcDiNA3-B 200μg组；pcDNA3-B1000μg组。一免后三周进行二免,二免后9d,按每头猪20000枚虫卵进行攻击感染,90d后剖检。结果表明,与非免疫对照组相比,猪囊尾蚴粗抗原组的减虫率为91.8％,pcDNA3-B 200μg的减虫率为36.6％,pcDNA3-B 1000μg组的减虫率为92.6％,实验猪的4/5头没有检出具有活力的猪囊尾蚴。这些结果为今后利用AgB基因开发核酸疫苗提供了依据。
综上所述,本研究主要结果如下：①对猪带绦虫45W基因家族进行了系统、深入的比较研究,证实该基因家族至少有12个成员,而非先前认为的4个；②对45W-4B、TSOL18和AgB进行了修饰或表达条件优化,实现了外源基因在大肠杆菌和酵母中的高效表达,为抗原蛋白的规模化生产奠定了基础；③证明六钧蚴阶段45W和TSOL18重组抗原作为亚单位疫苗其免疫原性优于常规囊尾蚴粗抗原；④构建的AgB核酸疫苗不仅具有良好的免疫预防效果,而且有治疗囊尾蚴病的潜力；⑤证明IFN-γ和IL4重组质粒能分别增强TSOL18和45W-4BX重组抗原的免疫保护效果,可作为猪囊尾蚴病重组疫苗分子免疫增强剂。