论文部分内容阅读
第一部分:法舒地尔阻断ROCK对糖尿病和普通大鼠大脑中动脉缺血再灌注后出血转化的影响 目的:rtPA溶栓治疗是急性脑梗死治疗的最有效手段。糖尿病降低了脑梗死后溶栓治疗血管再通率，使梗死面积缩小不明显，神经功能恢复困难，梗死出血转化明显增加。RhoA/ROCK信号通路和血管内皮功能相关。目前阻断ROCK对糖尿病大鼠脑梗死rtPA溶栓治疗后出血转化的影响和机制尚不明确。本研究拟建立普通大鼠和糖尿病大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，分别给予法舒地尔阻断ROCK，研究RhoA/ROCK信号通路对糖尿病大鼠缺血再灌注后血脑屏障通透性、出血转化影响，分析其可能机制。 方法:将140只雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham)20只，普通组和1型糖尿病组各60只。假手术组给予安慰剂加假手术处理。普通组和1型糖尿病组分别用线栓阻塞大鼠右侧大脑中动脉90分钟后给予rtPA尾静脉注射，120分钟拔栓再灌注，从而得到普通大脑中动脉缺血再灌注模型、糖尿病大脑中动脉缺血再灌注模型。对上述两组各随机分为两组（各30只），分别给予生理盐水或法舒地尔干预，形成普通大脑中动脉缺血再灌注+生理盐水组(CIRS)、普通大脑中动脉缺血再灌注+法舒地尔组(ORF)、糖尿病大脑中动脉缺血再灌注+生理盐水组(DMCIRS)、糖尿病大脑中动脉缺血再灌注+法舒地尔组（DMCIRF）。法舒地尔干预的两组在缺血再灌注的同时，腹腔注射5mg/kg的法舒地尔1次，继之梗死后12h注射1次，梗死后24小时注射1次，共3次。生理盐水对照的两组取相同体积的生理盐水代替法舒地尔腹腔注射。测定梗死后神经功能，缺血再灌注后24小时（梗死后26小时）ROCK蛋白活性、SOD、GSH-Px、MDA、基质金属蛋白酶MMP9、紧密连接蛋白occludin水平，以及相应血脑屏障通透性、出血转化情况。 结果:和假手术组相比，4小时和26小时神经功能评分各组神经功能均增高(P＜0.05)。CIRS组、CIRF组、DMCIRS组、DMCIRF组在梗死4小时后神经功能评分无统计学差异(P＞0.05)。26小时后CIRS组、CIRF组神经功能评分低于DMCIRS组、DMCIRF组(P＜0.05)，CIRS组较CIRF组差(P＜0.05)，DMCIRS组较DMCIRF组差(P＜0.05)。和假手术组相比，缺血后26小时TTC染色梗死体积在CIRS组、CIRF组、DMCIRS组、DMCIRF组均增高(P＜0.05)。糖尿病大鼠组较普通组梗死严重(P＜0.05)，法舒地尔干预组较对照组梗死轻(P＜0.05)。脑缺血再灌注24 h后（梗死后26小时）CIRS组缺血侧脑组织内血红蛋白含量明显多于CIRF组(447.83±44.15μg/g vs.303.33±52.03μg/g，P＜0.05)，DMCIRS组缺血侧脑组织内血红蛋白含量明显多于DMCIRF组和CIRS组(646.67±97.71μg/g vs.496.67±61.54μg/g vs303.33±52.03μg/g，P＜0.05)。DMCIRF组缺血侧脑组织内血红蛋白含量明显多于CIRF组（496.67±61.54μg/g vs.303.33±52.03μg/g,P＜0.05）。同时，CIRS组缺血侧脑组织内EB含量明显多于CIRF组（4.98±0.43μg/g vs.3.26±0.73μg/g，P＜0.05），DMCIRS组缺血侧脑组织内EB含量明显多于DMCIRF组和CIRS组（7.01±1.02μg/g vs.5.50±0.47μg/g vs4.98±0.43μg/g，P＜0.05）。DMCIRF组缺血侧脑组织内EB含量明显多于CIRF组（5.50±0.47μg/g vs.3.26±0.73μg/g，P＜0.05）。脑缺血再灌注24 h后CIRS组缺血侧脑组织内occludin表达明显少于CIRF组(P＜0.05)，DMCIRS组缺血侧脑组织内occludin表达明显少于DMCIRF组(P＜0.05)和CIRS组(P＜0.05)。DMCIRF组缺血侧脑组织内occludin表达明显低于CIRF组(P＜0.05)。脑缺血再灌注24 h后大鼠缺血侧大脑组织MMP9表达增加，糖尿病大鼠两组较高(P＜0.05)，法舒地尔干预两组缺血侧脑组织内MMP9表达明显高于对照两组组(P＜0.05)。糖尿病大鼠两组缺血侧脑组织内ROCK活性高于普通大鼠两组(P＜0.05)，法舒地尔干预两组缺血侧脑组织内ROCK活性小于对照两组(P＜0.05)。脑缺血再灌注24 h后大鼠缺血侧大脑组织SOD、GSH-Px减少，MDA增加，DMCIRS组最为明显。相比CIRS组，DMCIRS组缺血侧脑组织内SOD、GSH-P降低，MDA增高(P＜0.05)(P＜0.05)，说明糖尿病增加了脑缺血再灌注后氧化应激反应。相比CIRS组，CIRF组缺血侧脑组织内SOD、GSH-P较高，MDA较低(P＜0.05);相比DMCIRS组，DMCIRF组缺血侧脑组织内SOD、GSH-P较高，MDA较低(P＜0.05)。 结论:在糖尿病和非糖尿病大鼠大脑中动脉缺血再灌注后，法舒地尔干预后ROCK活性下降，MMP9表达增加，occludin降解减少，血脑屏障通透性下调，出血转化减少，提示RhoA/ROCK信号通路在脑缺血再灌注过程中对血脑屏障的作用部分通过MMP9完成。氧化应激水平在糖尿病大鼠中缺血再灌注过程中较高，是血脑屏障破坏因素。法舒地尔干预降低了氧化应激水平，提示RhoA/ROCK信号通路在脑缺血再灌注过程中对血脑屏障的作用也和氧化应激部分相关。 第二部分:激动PPARr调节RhoA活性对大鼠大脑中动脉缺血再灌注后出血转化的影响 目的:已有研究表明PPARγ激动剂吡格列酮有脑保护作用。脑缺血再灌注后RhoA/ROCK信号通路激活对血脑屏障有破坏作用。血管内皮细胞内PPARγ促进泛素途径对RhoA降解，降低RhoA活性。本研究通过观察激动、沉默、沉默后激动PPARγ对脑缺血再灌注后RhoA/ROCK信号通路、血脑屏障通透性相关指标、出血转化的影响，分析相关机制。 方法:将140只雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham）20只和模型组120只。假手术组给予安慰剂加假手术处理。模型组用颅内注射慢病毒介导PPARγRNA干扰来沉默内源性PPARγ基因，用慢病毒空载体对照。用来吡格列酮激动PPARγ，用吡格列酮的溶剂DMSO对照。模型组随机分为6组，每组20只，分别是:(1)缺血再灌注+安慰剂组（CIRP）:制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予DMSO腹腔内注射（体积等同于吡格列酮/DMSO溶液），梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。(2)缺血再灌注+空载体组(CIRV):梗死前7天颅内注射慢病毒空载体（体积等同于PPARγsiRNA慢病毒载体），饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型。(3)缺血再灌注+空载体组+安慰剂(CIRVP):梗死前7天颅内注射慢病毒空载体（体积等同于PPARγsiRNA慢病毒载体），饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予DMSO腹腔内注射（体积等同于吡格列酮/DMSO溶液），梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。(4)缺血再灌注+siRNA组（CIRI）:梗死前7天颅内注射siRNA慢病毒载体，饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予DMSO腹腔内注射（体积等同于吡格列酮/DMSO溶液），梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。(5)缺血再灌注+siRNA+PPARγ激动组(CIRIA):颅内注射siRNA慢病毒载体，饲养7天后制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予吡格列酮/DMSO溶液腹腔内注射，梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。(6)缺血再灌注+PPARγ激动组（CIRA）:制备MCAO缺血再灌注模型，再灌注时给予吡格列酮/DMSO溶液腹腔内注射，梗死后12小时重复给予1次，24小时重复给予1次。检测缺血后26小时（再灌注后24小时）后RhoA活性、ROCK活性氧化应激水平、MMP9表达、occludin表达的影响，以及相应血脑屏障通透性、出血转化情况。 结果:相比对照大鼠，沉默内源性PPARγ基因的大鼠降低PPARγ蛋白表达。在大脑中动脉缺血再灌注后，沉默内源性PPARγ基因的大鼠脑组织内RhoA活性增加，ROCK活性增加，MMP9表达增加，血管内皮紧密连接蛋白occludin降解加重，SOD、GSH-Px明显减少，MDA明显增加，缺血再灌注后出血转化增多和血脑屏障通透性上升。与之对应的是在大脑中动脉缺血再灌注后，吡格列酮激动PPARγ受体，导致大鼠脑组织内RhoA活性下降，ROCK活性下降，MMP9表达减少，血管内皮紧密连接蛋白occludin表达增加，SOD、GSH-Px明显增加，MDA明显下降，缺血再灌注后出血转化减少和血脑屏障完整性改善。但吡格列酮激动沉默了内源性PPARγ基因的大鼠则没有保护血脑屏障作用，其指标表现和沉默内源性PPARγ基因的大鼠一样。 结论: PPARγ受体在调控血脑屏障通透性上有关键性作用，PPARγ可通过调节RhoA活性，影响RhoA/ROCK信号通路，改变氧化应激和MMP9水平，对脑缺血再灌注过程后的血脑屏障通透性进行调控，影响缺血再灌注后出血转化。