目的:1.探索并设计一种新型角膜灌流培养系统,进而优化传统器官培养保存中角膜的生存环境,并预测其在角膜保存中应用的可行性。2.研究此新型培养系统对器官培养保存兔角膜的生存环境、内皮细胞活性的影响,检验其在器官培养角膜保存中的应用效果。3.使用本培养系统保存的兔角膜进行穿透性角膜移植(PKP)研究,进一步评价其在长期保存角膜内皮细胞(CEC)活性方面的可靠性。方法:1.利用制图软件设计一种带有底座和角膜固定结构的培养装置,并利用精密蠕动泵组合构建角膜灌流培养系统及动物模型。根据灌流速度不同,随机将20只兔角膜片分为4组进行灌流培养,时间为4周。保存到期后,检测培养液中pH值、葡萄糖、乳酸、微生物等指标;对各组角膜片行锥蓝联合茜素红活性染色计算CEC密度,观察不同灌流速度对角膜保存效果的影响,筛选最佳的灌流速度。2.利用新研制的角膜灌流培养系统以及传统的密闭和定期换液保存3种方式对60只兔角膜进行器官培养保存实验,每种方法又按保存时间1周、2周、3周、4周分为4个小组,每小组各保存5只角膜,另有2只角膜进行灌流培养保存2月。保存到期后,检测培养液中pH值、葡萄糖、乳酸、微生物学等指标;对各组角膜片行锥蓝联合茜素红活性染色计算CEC密度、死亡率、六角形细胞百分率;对保存时间最长组角膜行Na+-K+ATP酶及琥珀酸脱氢酶酶组织化学染色及透射电镜观察。3.新西兰大白兔15只,其中5只(10只角膜)作为PKP供体,10只作为PKP受体。供体角膜用灌流培养方法进行培养保存,按保存时间4周、8周分为两组,每小组各保存5只角膜,两组均行穿透性角膜移植动物实验。术后不同时间对所有实验动物进行大体观察、裂隙灯检查、A超角膜测厚。术后30d处死后,对植片CEC进行锥蓝茜素红联合染色检查。结果:1.实验室构建的动物模型进行灌流培养,除流速在5ul/min时,保存前后培养液主要成分变化有显著性外,其余三组无明显变化;综合培养效果及培养液用量考虑,10ul/min的灌流速度相对更加具有优势。2.不同保存方式间比较显示,灌流培养能够提供相对稳定的培养环境,有效地防止污染.经灌流培养后的角膜与其他方法保存后的相比拥有更高的CEC密度、更好的酶组织活性以及细胞超微结构。3.经灌流培养保存后的兔角膜行PKP术,术后观察各组植片厚度均逐渐减小,术后30天时植片均透明。植片活性染色均可见较高密度的活性CEC存在。各组PKP术后的植片透明率、厚度无明显差异。结论:1.研究结果表明,本实验室研制的角膜灌流培养系统性能可靠,在长期保存CEC活性方面具有可行性。2.动物模型结果表明,灌流培养可以优化角膜的生存环境,更接近体内的生理条件,可以在较长时间内有效保存CEC活性,灌流培养比传统密闭及定期换液培养更具优势。3. PKP动物实验表明,灌流培养系统保证了角膜在体外更长时间的生存,长时间保存后的角膜进行移植效果确切。