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目的:1.研究β-谷甾醇(β-Sitosterol,BS)单药及联合吉西他滨(Gemcitabine,GEM)对人胰腺癌细胞MIA-Pa Ca-2和BXPC-3的增殖、凋亡及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。2.观察BS联合GEM对裸鼠皮下瘤细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响及其作用机制。方法:1.BS对人胰腺癌细胞MIA-Pa Ca-2和BXPC-3增殖、凋亡和上皮间质转化的影响:不同浓度BS干预人胰腺癌细胞24 h、48 h、72 h,MTT法检测细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期和凋亡、Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡、Transwell小室检测细胞迁移和侵袭。Western blot法检测BS及BAY(NF-κB受体抑制剂)对凋亡信号通路蛋白NF-κB、p-NF-κB、Bax、Bcl-2表达的影响;给予BS、PER(AKT受体抑制剂)和Li CL(GSK-3β受体抑制剂)后对EMT信号通路蛋白AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail、Vimentin、E-cadherin表达的影响。2.BS联合GEM对人胰腺癌细胞MIA-Pa Ca-2和BXPC-3的增殖、凋亡和上皮间质转化的影响:BS联合GEM干预人胰腺癌细胞24 h、48 h、72 h,MTT法检测细胞增殖、Calcusyn 2.1软件确定最佳联合方式、流式细胞术分析细胞周期和凋亡、Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡、Transwell小室检测细胞迁移和侵袭情况。Western blot法检测对凋亡信号通路蛋白NF-κB、p-NF-κB、Bax、Bcl-2及EMT信号通路蛋白AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail、Vimentin、E-cadherin表达的影响。3.BS联合GEM对人胰腺癌裸鼠皮下瘤细胞增殖、凋亡及EMT的影响:建立人胰腺癌BXPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤模型,实验设对照、BS、GEM、BS+GEM。每两天测一次裸鼠体重、瘤体积,给药四周后处死,计算脏器指数,测量瘤重量。免疫组化法检测瘤组织Ki-67、p-NF-κB、Bax、Bcl-2、p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin、E-cadherin表达。Tunel染色法观察细胞凋亡。结果:1.随给药浓度增加和时间延长,MTT法显示BS对人胰腺癌细胞的增殖抑制作用增强。流式细胞术表明凋亡细胞增加,处于G0/G1期细胞的百分比明显增多。Hoechst 33258染色显示细胞凋亡增加。Transwell迁移和侵袭实验显示穿膜细胞明显减少。Western blot结果显示,与对照组相比,给予BS及BAY后,NF-κB蛋白表达无明显变化,p-NF-κB和Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达上升。给予BS及PER后,AKT,GSK-3β蛋白表达无明显变化;p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin蛋白表达下降,E-cadherin蛋白表达增加。给予Li CL后,GSK-3β蛋白表达无明显变化,p-GSK-3β、Snail、Vimentin蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达下降。2.与对照、BS、GEM相比,BS+GEM可明显抑制人胰腺癌细胞的增殖;Calcusyn 2.1软件结果表明,250μmol/L的BS联合50μmol/L的GEM抑制作用最强。流式细胞术结果表明,BS+GEM可使凋亡细胞和阻滞在G0/G1期细胞的百分比增多。Hoechst 33258染色法结果显示,BS+GEM可使凋亡细胞增多。Transwell迁移和侵袭实验显示,BS+GEM可使穿膜细胞数明显减少。Western blot结果显示,与对照、BS、GEM相比,BS+GEM干预后,NF-κB和AKT蛋白表达无明显变化,p-NF-κB、Bcl-2、p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin蛋白表达减少,Bax和E-cadherin蛋白表达增多。3.结果显示,对照组、BS组、GEM组、BS+GEM组裸鼠体重和脏器指数未见明显变化。与对照、BS、GEM相比,BS+GEM组裸鼠瘤体积和瘤重量最小。与对照组、BS、GEM相比,BS+GEM组免疫组化显示Ki67、p-NF-κB、Bcl-2、p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin表达最少,Bax和E-cadherin表达最多。Tunel染色显示凋亡细胞增多。结论:1.BS能抑制人胰腺癌的增殖、诱导其凋亡,抑制其迁移和侵袭,通过AKT/GSK-3β信号通路抑制其上皮间质转化。2.BS联合GEM明显优于单药,表现在能明显抑制人胰腺癌细胞的增殖、诱导凋亡,抑制迁移和侵袭,通过AKT/GSK-3β信号通路抑制其上皮间质转化。3.BS联合GEM对人胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用明显优于单药。