β-谷甾醇协同吉西他滨通过诱导凋亡和抑制上皮间质转化的抗胰腺癌作用研究

来源 :兰州大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:tianshi581
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目的:1.研究β-谷甾醇(β-Sitosterol,BS)单药及联合吉西他滨(Gemcitabine,GEM)对人胰腺癌细胞MIA-Pa Ca-2和BXPC-3的增殖、凋亡及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。2.观察BS联合GEM对裸鼠皮下瘤细胞增殖、凋亡及上皮间质转化的影响及其作用机制。方法:1.BS对人胰腺癌细胞MIA-Pa Ca-2和BXPC-3增殖、凋亡和上皮间质转化的影响:不同浓度BS干预人胰腺癌细胞24 h、48 h、72 h,MTT法检测细胞增殖、流式细胞术分析细胞周期和凋亡、Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡、Transwell小室检测细胞迁移和侵袭。Western blot法检测BS及BAY(NF-κB受体抑制剂)对凋亡信号通路蛋白NF-κB、p-NF-κB、Bax、Bcl-2表达的影响;给予BS、PER(AKT受体抑制剂)和Li CL(GSK-3β受体抑制剂)后对EMT信号通路蛋白AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail、Vimentin、E-cadherin表达的影响。2.BS联合GEM对人胰腺癌细胞MIA-Pa Ca-2和BXPC-3的增殖、凋亡和上皮间质转化的影响:BS联合GEM干预人胰腺癌细胞24 h、48 h、72 h,MTT法检测细胞增殖、Calcusyn 2.1软件确定最佳联合方式、流式细胞术分析细胞周期和凋亡、Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡、Transwell小室检测细胞迁移和侵袭情况。Western blot法检测对凋亡信号通路蛋白NF-κB、p-NF-κB、Bax、Bcl-2及EMT信号通路蛋白AKT、p-AKT、GSK-3β、p-GSK-3β、Snail、Vimentin、E-cadherin表达的影响。3.BS联合GEM对人胰腺癌裸鼠皮下瘤细胞增殖、凋亡及EMT的影响:建立人胰腺癌BXPC-3细胞裸鼠皮下移植瘤模型,实验设对照、BS、GEM、BS+GEM。每两天测一次裸鼠体重、瘤体积,给药四周后处死,计算脏器指数,测量瘤重量。免疫组化法检测瘤组织Ki-67、p-NF-κB、Bax、Bcl-2、p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin、E-cadherin表达。Tunel染色法观察细胞凋亡。结果:1.随给药浓度增加和时间延长,MTT法显示BS对人胰腺癌细胞的增殖抑制作用增强。流式细胞术表明凋亡细胞增加,处于G0/G1期细胞的百分比明显增多。Hoechst 33258染色显示细胞凋亡增加。Transwell迁移和侵袭实验显示穿膜细胞明显减少。Western blot结果显示,与对照组相比,给予BS及BAY后,NF-κB蛋白表达无明显变化,p-NF-κB和Bcl-2蛋白表达下降,Bax蛋白表达上升。给予BS及PER后,AKT,GSK-3β蛋白表达无明显变化;p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin蛋白表达下降,E-cadherin蛋白表达增加。给予Li CL后,GSK-3β蛋白表达无明显变化,p-GSK-3β、Snail、Vimentin蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达下降。2.与对照、BS、GEM相比,BS+GEM可明显抑制人胰腺癌细胞的增殖;Calcusyn 2.1软件结果表明,250μmol/L的BS联合50μmol/L的GEM抑制作用最强。流式细胞术结果表明,BS+GEM可使凋亡细胞和阻滞在G0/G1期细胞的百分比增多。Hoechst 33258染色法结果显示,BS+GEM可使凋亡细胞增多。Transwell迁移和侵袭实验显示,BS+GEM可使穿膜细胞数明显减少。Western blot结果显示,与对照、BS、GEM相比,BS+GEM干预后,NF-κB和AKT蛋白表达无明显变化,p-NF-κB、Bcl-2、p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin蛋白表达减少,Bax和E-cadherin蛋白表达增多。3.结果显示,对照组、BS组、GEM组、BS+GEM组裸鼠体重和脏器指数未见明显变化。与对照、BS、GEM相比,BS+GEM组裸鼠瘤体积和瘤重量最小。与对照组、BS、GEM相比,BS+GEM组免疫组化显示Ki67、p-NF-κB、Bcl-2、p-AKT、p-GSK-3β、Snail、Vimentin表达最少,Bax和E-cadherin表达最多。Tunel染色显示凋亡细胞增多。结论:1.BS能抑制人胰腺癌的增殖、诱导其凋亡,抑制其迁移和侵袭,通过AKT/GSK-3β信号通路抑制其上皮间质转化。2.BS联合GEM明显优于单药,表现在能明显抑制人胰腺癌细胞的增殖、诱导凋亡,抑制迁移和侵袭,通过AKT/GSK-3β信号通路抑制其上皮间质转化。3.BS联合GEM对人胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的抑制作用明显优于单药。
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