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目的:通过研究以性别决定区Y蛋白5(SexdeterminingregionY-boxprotein5,SOX5)和GATA结合蛋白3(GATA-blndingprotein3)为核心节点的调控网络在卡波氏肉瘤(KaposisSarcoma,KS)细胞增殖凋亡过程中作用,揭示转录因子SOX5、GATA3影响KS发生发展的分子机制,从而为KS治疗提供可能的靶点和理论依据。
方法:采用免疫组化和实时荧光定量PCR技术,分别检测SOX5,GATA3在经典型KS患者肿瘤和瘤旁组织中的表达;进一步以卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus,KSHV)感染的细胞株iSLK-219,iSLK-BAC及KSHV未感染的对照细胞株iSLK-PURO为研究对象,确定SOX5、GATA3在KSHV感染细胞株中的表达水平,并筛选出SOX5、GATA3共同调控的与细胞增殖、凋亡相关的下游靶基因,分别构建SOX5、GATA3真核表达载体,脂质体转染技术转染细胞后,通过CCK-8试剂盒与流式细胞仪检测SOX5、GATA3在KSHV感染的细胞中对细胞增殖、凋亡方面的影响;分别过表达SOX5、GATA3后,采用WesternBlot方法检测增殖相关蛋白PCNA,PKC,凋亡相关蛋白Bcl-2、C-PARP的表达;采用转录组测序的方法筛选SOX5、GATA3过表达后与细胞增殖凋亡相关的差异基因,探讨SOX5、GATA3影响细胞增殖、凋亡的可能信号通路,揭示SOX5、GATA3参与KS发生的具体机制。
结果:1.免疫组化和实时荧光定量PCR结果显示,SOX5、GATA3在经典型KS患者肿瘤组织中均呈现低表达,与瘤旁组织相比,差异具有显著性(P均<0.01),并且SOX5、GATA3表达均与地域差异和KS病程长短密切相关(P均<0.05)。
2.SOX5、GATA3在KSHV感染细胞株中的表达低于未感染的对照细胞株,差异具有显著性(P均<0.01)。
3.实时荧光定量PCR结果显示,SOX5、GATA3共同调控的18个靶基因中大多与增殖、凋亡密切相关。
4.CCK-8实验结果显示,将SOX5、GATA3真核表达载体分别转染入iSLK-219,iSLK-BAC细胞后,与转染空载体组相比,细胞生长速度减慢,增殖率明显降低(P均<0.01),这提示SOX5、GATA3均能抑制KSHV感染细胞株的增殖。
5.将SOX5、GATA3分别转染入iSLK-219,iSLK-BAC细胞后,与转染空载体组相比,凋亡率均显著升高(P均<0.05)。
6.分别过表达SOX5、GATA3后凋亡相关蛋白C-PARP表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,增殖相关蛋白PCNA、PKC表达下降,表明SOX5、GATA3能够抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。
7.过表达SOX5、GATA3后,通过对转录组测序结果进行分析并验证显示,SOX5、GATA3与JAK-STAT信号通路密切相关。
8.在iSLK-219细胞中过表达GATA3后,与转染空载体组细胞相比,ERK与STAT3总蛋白表达水平未见明显差异;而p-ERK与P-STAT3蛋白水平显著降低。
结论:1.SOX5与GATA3在经典型KS组织和KSHV感染细胞中均低表达。
2.SOX5与GATA3能抑制KSHV感染细胞株增殖,促进细胞凋亡。
3.GATA3在KSHV感染细胞中可通过抑制ERK与STAT3的磷酸化从而发挥抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。
方法:采用免疫组化和实时荧光定量PCR技术,分别检测SOX5,GATA3在经典型KS患者肿瘤和瘤旁组织中的表达;进一步以卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’ssarcoma-associatedherpesvirus,KSHV)感染的细胞株iSLK-219,iSLK-BAC及KSHV未感染的对照细胞株iSLK-PURO为研究对象,确定SOX5、GATA3在KSHV感染细胞株中的表达水平,并筛选出SOX5、GATA3共同调控的与细胞增殖、凋亡相关的下游靶基因,分别构建SOX5、GATA3真核表达载体,脂质体转染技术转染细胞后,通过CCK-8试剂盒与流式细胞仪检测SOX5、GATA3在KSHV感染的细胞中对细胞增殖、凋亡方面的影响;分别过表达SOX5、GATA3后,采用WesternBlot方法检测增殖相关蛋白PCNA,PKC,凋亡相关蛋白Bcl-2、C-PARP的表达;采用转录组测序的方法筛选SOX5、GATA3过表达后与细胞增殖凋亡相关的差异基因,探讨SOX5、GATA3影响细胞增殖、凋亡的可能信号通路,揭示SOX5、GATA3参与KS发生的具体机制。
结果:1.免疫组化和实时荧光定量PCR结果显示,SOX5、GATA3在经典型KS患者肿瘤组织中均呈现低表达,与瘤旁组织相比,差异具有显著性(P均<0.01),并且SOX5、GATA3表达均与地域差异和KS病程长短密切相关(P均<0.05)。
2.SOX5、GATA3在KSHV感染细胞株中的表达低于未感染的对照细胞株,差异具有显著性(P均<0.01)。
3.实时荧光定量PCR结果显示,SOX5、GATA3共同调控的18个靶基因中大多与增殖、凋亡密切相关。
4.CCK-8实验结果显示,将SOX5、GATA3真核表达载体分别转染入iSLK-219,iSLK-BAC细胞后,与转染空载体组相比,细胞生长速度减慢,增殖率明显降低(P均<0.01),这提示SOX5、GATA3均能抑制KSHV感染细胞株的增殖。
5.将SOX5、GATA3分别转染入iSLK-219,iSLK-BAC细胞后,与转染空载体组相比,凋亡率均显著升高(P均<0.05)。
6.分别过表达SOX5、GATA3后凋亡相关蛋白C-PARP表达增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,增殖相关蛋白PCNA、PKC表达下降,表明SOX5、GATA3能够抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。
7.过表达SOX5、GATA3后,通过对转录组测序结果进行分析并验证显示,SOX5、GATA3与JAK-STAT信号通路密切相关。
8.在iSLK-219细胞中过表达GATA3后,与转染空载体组细胞相比,ERK与STAT3总蛋白表达水平未见明显差异;而p-ERK与P-STAT3蛋白水平显著降低。
结论:1.SOX5与GATA3在经典型KS组织和KSHV感染细胞中均低表达。
2.SOX5与GATA3能抑制KSHV感染细胞株增殖,促进细胞凋亡。
3.GATA3在KSHV感染细胞中可通过抑制ERK与STAT3的磷酸化从而发挥抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。