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鱼类拥有先天免疫系统和获得性免疫系统，但其更加依赖先天免疫系统以抵抗病原微生物（诸如病菌和病毒）的入侵。青鱼是传统的“四大家鱼”之一，也是我国重要的淡水经济鱼类。自然水体和养殖水体中细菌、病毒或者寄生虫引起的疾病对青鱼的健康养殖造成了严重的威胁。为了阐明青鱼先天免疫机制，本论文对病原微生物刺激条件下青鱼组织全长转录组进行了测序分析，同时对先天免疫相关IKKε/TBK1/IRF信号通路进行了阐释。
本论文内容之一是采用第三代测序技术对青鱼进行全长转录组测序，并通过生物信息学方法对测序结果进行分析，主要研究结果如下：
借助PacbioSequel测序系统，将草鱼呼肠孤病毒（GCRV）以及迟缓爱德华氏菌（Edwardsiellatarda）刺激之后的青鱼脾脏、肝脏和肾脏总RNA逆转录之后等量混合测序，得到的总reads数5663655条，总数据量为10.9G。通过对转录本进行质量控制，得到高质量的Isform7183条，低质量的Isform49942条。结合之前得到的青鱼二代转录组信息，从两种质量的Isform中筛选出35608条Unigene。通过BUSCO数据库进行数据的完整性评估，发现匹配的基因数为221条，占比73％。之后通过常见数据库对得到的转录本进行注释：NR注释中，有29068条Unigene基因被注释出来，占总Unigene数的81.63%。同源性分析发现，与犀角金线鲃同源的基因序列有6392条，占比22.05%。KEGG注释中，所有转录本中涉及信号转导的基因最多，其次是运输、分解代谢、分子折叠整理和降解相关的基因。KOG注释中，转录本主要集中在信号转导机制、翻译后修饰、蛋白质转化以及分子伴侣等基因。GO注释的三类中：在细胞学组件一类，构成细胞和细胞组分以及细胞器的转录本最多；在分子功能一类，行使结合功能的转录本最多，其次是催化活性；在生物学途径一类，注释到细胞过程的转录本最多，其次是新陈代谢以及生物调节。除了常见的数据库注释之外，本论文还对所得到的转录本进行了转录因子注释、lncRNA分析以及转座元件分析。本论文共分析鉴定了3956条转录因子序列，2274条lncRNA序列以及1338条转座元件。
本论文内容之二是青鱼IKKε/TBK1/IRF信号通路中相关基因的功能机制研究，主要研究结果如下：
qPCR实验证明LPS,poly(I:C)，鲤春病毒血症病毒（SVCV）以及GCRV的刺激都能够诱导青鱼肾脏体外培养细胞（MPK）及青鱼尾鳍体外培养细胞（MPF）中IRF3及IRF7的表达。过表达青鱼IRF3及IRF7的EPC细胞抵抗SVCV及GCRV的能力较对照组而言有所增强。免疫荧光实验表明病毒感染会导致青鱼IRF3及IRF7从细胞质转移到细胞核。免疫共沉淀实验证明：青鱼IRF3分子之间能够相互结合，暗示其能形成同源二聚体；IRF3与IRF7也能相互结合，暗示两者能够形成异源二聚体以刺激干扰素的表达。通过构建青鱼IRF3及IRF7的突变体来探究不同结构域对青鱼IRF3及IRF7功能的影响， 结果发现：DBD结构域是青鱼IRF3及IRF7发挥功能所必须的；SRD的缺失会部分影响青鱼IRF3及IRF7的功能；青鱼IRF3的IAD结构域对IRF3发挥完全功能是必不可少的，但是青鱼IRF7的IAD结构域却能够抑制IRF7的功能。免疫荧光实验表明，青鱼IRF3及IRF7的IAD结构域缺失突变体大部分都集中在细胞核中。本论文还对上游激酶TBK1和IKKε与IRF3及IRF7的互作关系进行了研究，结果表明：青鱼TBK1调节干扰素的能力依赖于IRF3以及IRF7；TBK1及IKKε均能够增强IRF3及IRF7上调干扰素的能力；TBK1及IKKε均能够增强IRF7的抗病毒能力。总之，青鱼TBK1及IKKε均能激活IRF3及IRF7、从而调节干扰素的表达。
本论文内容之三是青鱼SIKE的克隆及功能研究。主要研究结果如下：
借助青鱼全长转录组信息，从免疫相关基因中筛选出SIKE基因的全长序列。青鱼SIKE基因全长cDNA由1144个核苷酸组成，其中5-UTR为210bp，3-UTR为292bp，ORF为642bp，SIKE预计分子量为25kDa。同源性分析发现，青鱼SIKE与鲤鱼和斑马鱼的SIKE氨基酸相似度分别为93.0%和94.4%。qPCR结果显示青鱼SIKE参与了由SVCV和GCRV引发的宿主先天免疫应答。免疫荧光数据表明青鱼SIKE主要分布在细胞质中。双荧光素酶实验数据显示青鱼SIKE自身不具有调节干扰素的能力，但其对青鱼RLR/IFN信号通路起明显的抑制作用。免疫荧光数据显示青鱼SIKE和TBK1在MPF细胞中呈现相同的亚细胞分布,Co-IP数据显示了这两种蛋白之间存在直接相互作用。细胞攻毒和噬斑实验证明青鱼SIKE在宿主先天免疫激活过程中负调节TBK1介导的抗病毒活性。另外，青鱼SIKE同样能够与IKKε结合并抑制其调节IRF7的功能。总之，青鱼SIKE在RLR信号通路中起到抑制作用，并且TBK1和IKKε都是它的靶蛋白。
综上所述，本论文对青鱼先天免疫应答过程中的转录组进行了较为系统的测序及分析，剖析了青鱼IKKε/TBK1/IRF信号通路在宿主抗病毒先天免疫中的功能及调节机制等，为系统阐明青鱼先天免疫抗病毒机制提供了新的数据，为青鱼健康养殖提供了新的参考。
本论文内容之一是采用第三代测序技术对青鱼进行全长转录组测序，并通过生物信息学方法对测序结果进行分析，主要研究结果如下：
借助PacbioSequel测序系统，将草鱼呼肠孤病毒（GCRV）以及迟缓爱德华氏菌（Edwardsiellatarda）刺激之后的青鱼脾脏、肝脏和肾脏总RNA逆转录之后等量混合测序，得到的总reads数5663655条，总数据量为10.9G。通过对转录本进行质量控制，得到高质量的Isform7183条，低质量的Isform49942条。结合之前得到的青鱼二代转录组信息，从两种质量的Isform中筛选出35608条Unigene。通过BUSCO数据库进行数据的完整性评估，发现匹配的基因数为221条，占比73％。之后通过常见数据库对得到的转录本进行注释：NR注释中，有29068条Unigene基因被注释出来，占总Unigene数的81.63%。同源性分析发现，与犀角金线鲃同源的基因序列有6392条，占比22.05%。KEGG注释中，所有转录本中涉及信号转导的基因最多，其次是运输、分解代谢、分子折叠整理和降解相关的基因。KOG注释中，转录本主要集中在信号转导机制、翻译后修饰、蛋白质转化以及分子伴侣等基因。GO注释的三类中：在细胞学组件一类，构成细胞和细胞组分以及细胞器的转录本最多；在分子功能一类，行使结合功能的转录本最多，其次是催化活性；在生物学途径一类，注释到细胞过程的转录本最多，其次是新陈代谢以及生物调节。除了常见的数据库注释之外，本论文还对所得到的转录本进行了转录因子注释、lncRNA分析以及转座元件分析。本论文共分析鉴定了3956条转录因子序列，2274条lncRNA序列以及1338条转座元件。
本论文内容之二是青鱼IKKε/TBK1/IRF信号通路中相关基因的功能机制研究，主要研究结果如下：
qPCR实验证明LPS,poly(I:C)，鲤春病毒血症病毒（SVCV）以及GCRV的刺激都能够诱导青鱼肾脏体外培养细胞（MPK）及青鱼尾鳍体外培养细胞（MPF）中IRF3及IRF7的表达。过表达青鱼IRF3及IRF7的EPC细胞抵抗SVCV及GCRV的能力较对照组而言有所增强。免疫荧光实验表明病毒感染会导致青鱼IRF3及IRF7从细胞质转移到细胞核。免疫共沉淀实验证明：青鱼IRF3分子之间能够相互结合，暗示其能形成同源二聚体；IRF3与IRF7也能相互结合，暗示两者能够形成异源二聚体以刺激干扰素的表达。通过构建青鱼IRF3及IRF7的突变体来探究不同结构域对青鱼IRF3及IRF7功能的影响， 结果发现：DBD结构域是青鱼IRF3及IRF7发挥功能所必须的；SRD的缺失会部分影响青鱼IRF3及IRF7的功能；青鱼IRF3的IAD结构域对IRF3发挥完全功能是必不可少的，但是青鱼IRF7的IAD结构域却能够抑制IRF7的功能。免疫荧光实验表明，青鱼IRF3及IRF7的IAD结构域缺失突变体大部分都集中在细胞核中。本论文还对上游激酶TBK1和IKKε与IRF3及IRF7的互作关系进行了研究，结果表明：青鱼TBK1调节干扰素的能力依赖于IRF3以及IRF7；TBK1及IKKε均能够增强IRF3及IRF7上调干扰素的能力；TBK1及IKKε均能够增强IRF7的抗病毒能力。总之，青鱼TBK1及IKKε均能激活IRF3及IRF7、从而调节干扰素的表达。
本论文内容之三是青鱼SIKE的克隆及功能研究。主要研究结果如下：
借助青鱼全长转录组信息，从免疫相关基因中筛选出SIKE基因的全长序列。青鱼SIKE基因全长cDNA由1144个核苷酸组成，其中5-UTR为210bp，3-UTR为292bp，ORF为642bp，SIKE预计分子量为25kDa。同源性分析发现，青鱼SIKE与鲤鱼和斑马鱼的SIKE氨基酸相似度分别为93.0%和94.4%。qPCR结果显示青鱼SIKE参与了由SVCV和GCRV引发的宿主先天免疫应答。免疫荧光数据表明青鱼SIKE主要分布在细胞质中。双荧光素酶实验数据显示青鱼SIKE自身不具有调节干扰素的能力，但其对青鱼RLR/IFN信号通路起明显的抑制作用。免疫荧光数据显示青鱼SIKE和TBK1在MPF细胞中呈现相同的亚细胞分布,Co-IP数据显示了这两种蛋白之间存在直接相互作用。细胞攻毒和噬斑实验证明青鱼SIKE在宿主先天免疫激活过程中负调节TBK1介导的抗病毒活性。另外，青鱼SIKE同样能够与IKKε结合并抑制其调节IRF7的功能。总之，青鱼SIKE在RLR信号通路中起到抑制作用，并且TBK1和IKKε都是它的靶蛋白。
综上所述，本论文对青鱼先天免疫应答过程中的转录组进行了较为系统的测序及分析，剖析了青鱼IKKε/TBK1/IRF信号通路在宿主抗病毒先天免疫中的功能及调节机制等，为系统阐明青鱼先天免疫抗病毒机制提供了新的数据，为青鱼健康养殖提供了新的参考。