糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已成为21世纪世界流行病之一，据统计到2010年患病人数达2.40亿，到2025年可达2.99亿。由于糖尿病可以引起冠心病、脑卒中、失明、截肢等严重后果，糖尿病及其并发症的防治已经给各国造成了严重的经济负担和社会压力。心血管疾病是DM患者致残、致死，并造成经济损失的主要原因，现已把防治心血管并发症作为当今治疗DM的主题，也就是说完成了从DM的昏迷时代到感染时代到心血管时代的飞跃。　　 糖尿病是冠心病的等危症，糖尿病引起心血管并发症的危害性已逐渐受到重视。目前，糖尿病对心脏的损害局限于对大血管、微血管、动脉粥样硬化的研究，国内外对糖毒性对心肌细胞的直接伤害报道少见。本文通过以体外培养的H9C2心肌细胞为模型，探讨不同糖浓度环境下心肌细胞糖代谢状况的表达，发现高糖情况下心肌细胞存在胰岛素抵抗及凋亡，揭示糖毒性对心肌细胞存在直接伤害作用，为糖尿病对心脏的损害阐明另一途径。　　 Ghrelin是1999年日本科学家Kojima等从大鼠胃组织中分离和纯化了一个由28个氨基酸组成的小分子活性肽，并证实其为生长激素促分泌物受体(Growthhormone secretagogue receptor，GHS-R)的内源性配体。研究表明ghrelin在心血管的能量代谢、内分泌效应、血管效应及细胞效应方面发挥了广泛的作用，Ghrelin对于心血管系统的作用提示其可能在心衰、动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)及心肌损伤等病变的防治上具有广阔的前景。　　 目前国内外并未见ghrelin干预后心肌细胞糖代谢的变化及对糖毒性的影响的报道。我们知道PI3-Kinase/AKT通路是细胞内重要的信号转导通路，这条通路不仅在胰岛素信号转导中起到很重要的作用，同时也是细胞凋亡过程中重要的一环。本研究利用RT-PCR及Western方法对不同浓度葡萄糖的大鼠心肌细胞进行mRNA及蛋白定量检测，揭示出Ghrelin对高糖作用下的心肌细胞起到保护作用的机制。本文力求对高糖引起的心肌细胞的直接伤害作用及Ghrelin的功能的深入研究作出贡献，为临床治疗提供新的方向与思路。　　 材料与方法：　　 一、实验材料　　 1、H9C2大鼠心肌细胞系；　　 2、3H-G(3氚标记-葡萄糖)心肌细胞糖摄取实验相关试剂；　　 3、免疫荧光染色的相关试剂；　　 4、流式细胞仪检测凋亡的相关试剂；　　 5、半定量RT-PCR检测基因mRNA的相关试剂；　　 6、Western印迹杂交相关试剂；　　 二、实验方法　　 1、细胞培养鼠胚心肌细胞(H9C2)在DMEM培养基和10％胎牛血清中于37℃、5％CO2条件下进行培养，隔天换液，细胞单层生长达80％培养面积后，用0.25％胰蛋白酶消化，根据情况1:2或1:3传代，将传至6-7代的细胞用于实验。当细胞呈对数生长后，调整细胞数为1×106/L，接种于6孔培养板或30 mm培养皿中，待细胞生长至融合状态后用无血清培养基培养24h使细胞呈静止状态，更换实验用液随机分配为实验组及对照组进行实验。　　 2、实验分组　　 A、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素；　　 B、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素；　　 C、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素+10-8mol/L Ghrelin；　　 D、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素+10-8mol/L Ghrelin；　　 E、5.5mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素+10-7mol/L Ghrelin；　　 F、25 mmol/l葡萄糖+10mU/ml胰岛素+10-7mol/L Ghrelin。　　 3、同位素示踪法检测不同葡萄糖浓度时，心肌细胞3氚标记-葡萄糖(3H-G)摄取的变化待传代培养后的细胞处于80-90％融合状态时用于实验。KRH缓冲液洗涤细胞3次。用400ulKRH孵育细胞37℃孵育30min。弃去缓冲液，各组分共同继续孵育30分钟。加入3H-G至终浓度0.2uCi/ml30分钟。用预冷的PBS冲洗3次，将细胞裂解于0.5mol/LNaOH中，吹打混匀细胞(37℃裂解2小时)，收集细胞并离心(800r，2min)。样品移至液闪瓶内，加入液闪液(PPO4.0g、POPOP0.1g/1000ml二甲苯)2ml，液体闪烁计数法测定检测各组的CPM值。　　 4、吖啶橙(Acridine Orange，AO)荧光染色各实验组细胞按上述分组处理后，吸弃各孔中上清，PBS漂洗3次，每次3min，95％冷乙醇固定20min，滤纸吸干，1％醋酸作用30s，PBS洗1 min，加入0.01％AO染色5 min，PBS洗1 min，分色30 s，PBS洗3次，封片，于激发波长为405nm的荧光相差显微镜下立刻观察。　　 5、Hoechst33258染色将实验各组细胞按上述分组处理后，吸弃各孔中上清，PBS漂洗2次，每次3min，加入1 ml的4％甲醛溶液，4℃固定细胞10min，弃去固定液，PBS洗二次，滴加100μL Hoechst33258工作液，室温染色10min，流水冲净，于340nm波长的荧光显微镜下观察。　　 6、流式细胞仪检测H9C2细胞凋亡率细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，每样本细胞数为(1～5)×106/mL，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。用孵育缓冲液洗涤1次，500～1000r/min离心5min。用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。500～1000r/min离心5min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次。加入荧光(SA-FLOUS)溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。采用Cell QUEST软件进行采集分析。　　 7、细胞总RNA的提取及半定量RT-PCR检测GLUT4、PI3K、AKT/PKB、PPARr，LXRα、AMPK的表达诱导后的细胞处于80-90％融合状态时用于实验。PBS轻微冲洗2次后，细胞在无血清的低糖DMEM培养基中继续孵育24小时后，25mmol/l葡萄糖浓度下，分组同前，各组分别干预后，弃去培养基，用PBS轻微冲洗2次后，加入冰预冷的Trizol1ml，采用一步法提取细胞总RNA。细胞总RNA提取；RNA纯度及浓度测定；逆转录反应：cDNA第一链合成(反转录)；GLUT4、PI3K、AKT/PKB、PPARγ、LXRα、AMPK的引物序列及反应条件；制备3％琼脂糖凝胶；电泳；测定电泳条带密度值；扫描成像分析。　　 8、Western blot(免疫印记)检测磷酸化AKT蛋白变化特点(24h)及检测PAKT、PBad、Bcl-2、Bax蛋白的变化(48h)诱导后的细胞处于80-90％融合状态时用于实验。PBS轻微冲洗2次后，细胞在无血清的低糖DMEM培养基中继续孵育24小时及48h后，25mmol/l葡萄糖浓度下，分组同前，各组分别干预后收集细胞。蛋白收集及提取；蛋白质浓度测定；SDS-PAGE电泳；转膜；杂交；碱性磷酸酶显色；扫描成像分析。　　 9、分光光度计检测caspase-3活性收集实验各组细胞(3×106/组)，PBS洗二次，2000 r/min离心5 min，去除PBS，沉淀细胞中加入50μL冰冷裂解液和0.5μL DTT，吹打，冰上裂解60min，期间涡旋4次，每次10 s，4℃10000 r/min离心1min，吸取上清至新管中置冰上，测蛋白浓度，各组采用同样蛋白量进行实验，加50μL2×ReactionBuffer/DTTMix及DEVD-fmk1mL，冰浴30 min，加5μL Ac-DEVD-pNA，37℃2h。分光光度计在405nm波长测定其吸光值，计算OD诱导剂/OD阴性对照确定各组caspase-3活化程度。　　 10、统计学分析应用SPSS12.0统计软件进行分析，结果用均数±标准差(x±s)表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P<0.05差异有显著性。　　 结果：　　 1、不同葡萄糖浓度时，心肌细胞培养24小时3氚标记-葡萄糖(3H-G)及Ghrelin干预后摄取情况：与5.5mmol/l葡萄糖组比较，高糖组25.0mmol/l葡萄糖作用下3H-G摄取明显降低(P<0.01)。Ghrelin10-8mol/L干预后，心肌细胞3H-G摄取有所升高(P>0.05)；Ghrelin10-7mol/L干预后，心肌细胞3H-G摄取明显升高(P<0.05)。　　 2、流式细胞仪检测H9C2细胞凋亡率：不同葡萄糖浓度及Ghrelin干预后心肌细胞培养48小时，与5.5mmol/l葡萄糖组比较，高糖组25.0mmol/l葡萄糖作用下心肌细胞凋亡率明显增加；Ghrelin10-7mol/L干预后，心肌细胞凋亡率明显降低。　　 3、RT-PCR检测PI3K，PPARγ，LXRα，GLUT4和AMPK mRNA表达：PI3K，PPARγ，LXRα，GLUT4和AMPKmRNA高糖组水平明显降低(P<0.01或P<0.05)；10-8mol/L Ghrelin作用下水平升高不明显(P>0.05)；10-7mol/LGhrelin作用下水平明显升高(P<0.01或P<0.05)；说明ghrelin在10-7mol/L浓度时具有升高PI3K，PPARγ，LXRα，GLUT4和AMPK mRNA表达的作用，而10-8mol/L浓度时该作用不明显。　　 4、Western blot法检测磷酸化PI3KAKT蛋白变化特点(心肌细胞培养24小时)：高糖组PAKT水平明显降低(P<0.01)；10-8mol/L Ghrelin作用下，PAKT水平升高不明显(P>0.05)；10-7 mol/L Ghrelin作用下，PAKT水平明显升高(P<0.01)；说明ghrelin在10-7 mol/L浓度时具有升高PAKT蛋白表达的作用，而10-8 mol/L浓度时该作用不明显。　　 5、Western blot法检测PAKT、PBad及Bcl2、Bax蛋白变化特点(心肌细胞培养48小时)：高糖组PAKT、PBad及Bcl2明显降低(P<0.01)；10-8mol/L Ghrelin作用下，PAKT、PBad及Bcl2水平升高不明显(P>0.05)；10-7mol/L Ghrelin作用下，PAKT、PBad及Bcl2水平明显升高(P<0.01)；说明ghrelin在10-7mol/L浓度时具有升高PAKT、PBad及Bcl2蛋白表达的作用，而10-8 mol/L浓度时该作用不明显。免疫印迹法半定量Bax蛋白表达：高糖组Bax水平明显升高(P<0.01)；10-8mol/L Ghrelin作用下，Bax水平变化不明显(P>0.05)；10-7mol/L Ghrelin作用下，Bax水平下降(P<0.05)；说明ghrelin在10-7mol/L浓度时具有降低Bax蛋白表达的作用，而10-8 mol/L浓度时该作用不明显。　　 结论：　　 1、高糖对心肌细胞的直接伤害作用表现为抵抗和凋亡并存。　　 2、Ghrelin干预后可以改善高糖引起的心肌细胞的胰岛素抵抗；Ghrelin10-7mol/L可以防止心肌细胞的凋亡，故Ghrelin在高糖浓度下对心肌细胞有保护作用。　　 3、不同葡萄糖浓度下，Ghrelin改变了葡萄糖摄取的GLUT4 mRNA表达水平，Ghrelin通过GLUT4促进糖摄取；Ghrelin改变了AMPKmRNA的表达水平，说明AMPK在高糖毒性时参与了心肌细胞的葡萄糖摄取。　　 4、Ghrelin通过PI3K/AKT途径改善胰岛素抵抗；高糖毒性引起的心肌细胞凋亡是通过PI3K/AKT信号转导通路实现的，Ghrelin可通过激活磷酸化AKT表达，进而影响前凋亡基因Bad、抗凋亡基因Bcl-2和凋亡基因Bax表达，从而发挥抗心肌凋亡作用。Ghrelin其抗凋亡的作用与其浓度相关，在10-7mol/L时作用明显。