论文部分内容阅读
植入前遗传学诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD)是与辅助生殖技术相结合进行的一种遗传学诊断技术。PGD在遗传诊断后将无遗传缺陷的胚胎植入母体子宫,诊断在妊娠发生之前,因此防止了遗传病的发生。杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)是神经肌肉系统中最常见的X-连锁隐性遗传病,具有较高的发病率和死亡率,目前尚无有效治疗方法,主要通过产前诊断防止DMD患儿的出生。对DMD进行PGD不仅可以防止DMD患儿的出生,而且能够避免反复流产、引产对孕妇造成的身心伤害,是一种优于产前诊断的孕前诊断。由于PGD的分析材料极其有限,通常只有1-2个细胞,限制了DMD-PGD的开展,而常用的FISH’性别鉴定又导致正常男性胚胎的销毁,因此开展DMD-PGD,需建立有效的单细胞扩增方法和更安全的诊断技术。目的：本文旨在通过多重置换扩增(Multiple displacement amplification, MDA)及单倍体分析(haplotyping)的联合运用,探讨MDA和单倍体分析在DMD-PGD中应用的可行性,拟建立一种更为高效、安全的DMD-PGD方法。方法：选择高杂合度的8个STR位点及3个性别鉴定位点,对12对无DMD家族史的ICSI/IVF-ET夫妇的胚胎行MDA后的植入前单体型分析(Preimplantation genetic haplotyping, PGH)(其中3对仅用4个STR及1个性别鉴定位点)。首先采用MDA对单卵裂球细胞进行全基因组扩增,然后对胚胎及其亲本进行单倍体分析。在随机假设母本某一单体型为致病单体型的前提下,对胚胎进行遗传分析。结果：共收集胚胎19枚,其中双原核胚胎11枚,单原核胚胎1枚,三原核胚胎2枚,不明受精胚胎5枚。共取卵裂球51枚,1枚MDA发生污染,6枚MDA失败,单卵裂球MDA成功率86.3%(44/51)。44枚MDA成功的卵裂球单体型均获成功分析,单倍体分析成功率100%(44/44),MDA-PGH成功率86.3%(44/51)。33枚双原核胚胎卵裂球中,28枚MDA成功,MDA-PGH成功率84.9%(28/33),平均ADO (allele dropout)和AF (amplification failure)分别为25.3%和3.2%。在假设母亲某一单体型携带DMD3-11号和44-45号外显子缺失突变的前提下,25枚卵裂球单倍体分析结果示胚胎为正常男性或DMD女性携带者,另外3枚卵裂球为单倍体,示胚胎异常。取自异常受精胚胎的18枚卵裂球中,16枚MDA成功,MDA-PGH成功率88.9%(16/18)。结论：1.本实验MDA成功率86.3%,比文献报道稍低,单倍体分析成功率达100%,可联合用于临床PGD。2.对DMD行植入前单倍体分析,各单体型针对突变选择的STRs中,≥2个为有效位点时,选择4个和选择8个STRs的单倍体分析成功率均可达100%。3.单倍体分析联合性别鉴定,不仅可鉴定DMD女性携带者,还可鉴定正常男性胚胎,避免FISH性别鉴定造成正常男性胚胎的销毁。