荧光蛋白是重要的指示分子,已被广泛应用于生物学领域。为了适应不同的试验需求,人们尝试了多种方式对荧光蛋白进行改良。实验室前期将苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）杀虫蛋白Cry1Ia的N端分泌信号肽（Iasp）与EGFP融合,构建了一种新型融合荧光蛋白IEGFP。该蛋白p H稳定性与EGFP一致,且在大肠杆菌（Escherichia coli）和Bt中的表达量显著高于单独的EGFP,从而为宿主提供了更强的荧光信号。更重要的是,大部分表达产物保留了融合蛋白的完整分子大小,暗示IEGFP的跨膜转运效率较低。这些结果为其能够作为一种新型的荧光指示分子奠定了基础。为了验证IEGFP作为新型荧光指示分子的可行性,本研究首先对比了Iasp与两种已知重要分泌途径的信号肽在转运EGFP时的差异,并直接观察了三种融合荧光蛋白在大肠杆菌中分布。在确认其极低的转运性能后,进一步利用IEGFP作为指示分子对比了三种代表性Bt杀虫基因启动子Pv（vip3A）、Pac（cry1Ac）、Pi（cry1Ia）的活性差异,并监测了Pv在大肠杆菌和Bt中的表达模式。最后,鉴于Vip3A蛋白与Cry1Ia蛋白具有诸多相似的特点,我们还研究了Vip3A蛋白分泌信号肽（Vsp）是否具有类似Iasp的功能。通过研究,获得如下结果:首先,将Cry1Ia、果胶裂解酶B（pelB）和三甲胺氮氧化物还原酶（tor A）的分泌信号肽编码序列与egfp基因融合。将这些融合基因置于Pac启动子的3′端,并在大肠杆菌中表达。荧光信号强度检测和激光共聚焦显微观察的结果表明,表达IEGFP的宿主细胞荧光信号最强,并且主要定位于细胞质。tor A-EGFP可以顺利分泌到大肠杆菌周质空间,但荧光信号强度微弱。pel B-EGFP蛋白也能高效转运,但是无法产生荧光信号,且该蛋白的表达对宿主细胞的生长具有抑制作用。因此,我们认为Iasp与两种代表性的信号肽不同,能够改善EGFP蛋白在原核宿主细胞质中的表达,IEGFP具有作为荧光指示分子的潜力。进一步利用IEGFP作为指示分子对比了三种代表性的Bt杀虫基因启动子Pv、Pac、Pi的活性差异。将三种启动子分别连接到iegfp基因的5′端,指导该基因在大肠杆菌TG1菌株中表达。结果显示,在接种后的12 h,三种启动子调控表达的荧光信号强度依次递减(Pac>Pi>Pv)。我们还注意到,即使最弱的Pv,其活性也比对照(大肠杆菌乳糖操纵子阻遏蛋白Lac I基因的启动子,PlacI)高2倍左右。而活性最高的Pac活性约为PlacI突变体(PlacIq)的75%。利用IEGFP监测Pv的表达模式,结果发现该启动子在大肠杆菌中也是组成型启动子。在Bt细胞中,IEGFP的荧光信号强度在接种后24小时达到高峰,与已知表达模式一致。为了进一步了解IEGFP对弱启动子活性变化的敏感性,本研究对Pv的SD序列和起始密码子AUG之间的序列进行了改造。结果发现,IEGFP能够指示出6种不同的连接方式对Pv活性的影响差异。最后,本文探索了Vip3A信号肽（Vsp）是否具有与Iasp类似的效果。结果显示,在Pv的调控下,在大肠杆菌中,只检测到IEGFP蛋白发射的荧光信号,而无法检测到Vsp引导的EGFP融合蛋白VEGFP的荧光信号。为了揭示其原因,将vegfp基因置于强启动子T7的调控下,并在BL21-Star（DE3）中表达,结果显示VEGFP能够正常表达。但是约一半的表达产物被降解为EGFP分子大小。该结果暗示VEGFP的转运效率高于IEGFP。虽然,Vip3A蛋白的分泌途径尚未明确,但是,从VEGFP蛋白的荧光信号监测结果推测,它可能通过分泌后折叠的机制（Post translocation folding mechanism）转运到大肠杆菌的周质空间,因此无法正确折叠并发射荧光信号。这些结果说明Vsp不具备Iasp能够提高EGFP表达量的功能。有趣的是,Vip3A蛋白作为分泌性杀虫蛋白,其N端信号肽在转运过程中或转运后不被切除,但是本研究观察发现VEGFP中,该信号肽能够被切除。当然,该结果仍需要进一步研究确认。综上所述,IEGFP表现出较低的跨膜转运效率,并拥有比单独EGFP更高的表达量,因此,能够作为一种新型的荧光指示分子。