论文部分内容阅读
目的: 构建含有PON1基因过表达的重组慢病毒载体，通过在Balb/c小鼠中构建PON1过表达的动物模型，验证PON1调控及在小鼠体内的表达效果。观察调控PON1基因对敌敌畏急性中毒后小鼠肝损伤氧化应激水平和炎症因子指标的影响，探讨调控PON1对敌敌畏急性中毒小鼠肝损伤的保护作用。 方法: 1.携带PON1基因的慢病毒转染小鼠的验证 12只Balb/c小鼠随机分为3组，每组4只:正常对照组、Lv-GFP组、Lv-PON1组。将重组慢病毒载体经尾静脉转染小鼠后，各自连续0d、1d、3d、5d、7d、9d经眼底静脉丛取血，检测血清PON1活性水平，通过RT-PCR及Western blot技术验证PON1在肝组织中的表达。 2.携带PON1基因的慢病毒对敌敌畏中毒小鼠肝损伤的影响 (1).根据携带PON1基因慢病毒转染小鼠后的表达效果，选择在慢病毒转染小鼠后的第3d对小鼠进行敌敌畏染毒。96只Balb/c小鼠随机分为4组，每组24只:正常对照组、敌敌畏染毒组、Lv-GFP+敌敌畏组、Lv-PON1+敌敌畏组。将上述各组分为4个亚组，每亚组6只小鼠，分别于6h、12h、24h、48h麻醉处死留取标本。 (2).观察敌敌畏染毒后各组小鼠的行为变化及携带PON1基因慢病毒提前干预后对小鼠行为的影响，包括:呼吸、流泪、流涎、腹泻、精神状态等;光镜下观察肝组织的病理改变。 (3).化学比色法检测血清AST、ALT和AChE活力变化和肝组织MDA、GSH含量;酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠肝组织SOD、CAT、TNF-α、IL-1β水平;RT-PCR法检测肝组织PON1 mRNA和Nrf2mRNA表达;Western blot法检测PON1、NF-κBp65蛋白表达。 结果: 1.携带PON1基因的慢病毒转染小鼠的验证 携带PON1基因的慢病毒转染小鼠后，其血清PON1活性在第1d开始缓慢升高，自第3d起维持较高的活性水平;正常对照组和Lv-GFP组血清PON1活性一直处于相对低水平。RT-PCR和Western Blot结果显示，Lv-PON1组小鼠肝组织PON1mRNA和PON1蛋白表达明显高于正常对照组和Lv-GFP组。 2.携带PON1基因的慢病毒对敌敌畏中毒小鼠肝损伤的影响 (1).正常对照组小鼠呼吸平稳，活动自如，未见异常。敌敌畏染毒组小鼠染毒后出现流涎，腹泻，呼吸急促，步态不稳，肌肉震颤，精神萎靡，蜷缩成团，随着时间的延长其中毒症状逐渐缓解;携带PON1基因慢病毒提前干预后，小鼠的中毒症状较敌敌畏染毒组有所减轻。光镜下，小鼠在敌敌畏中毒后12h肝组织损伤变化最为显著，携带PON1基因慢病毒提前干预后小鼠肝损伤有所减轻。 (2).与正常对照组相比，敌敌畏染毒组各时间点肝组织PON1 mRNA和PON1蛋白的表达均显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);与敌敌畏染毒组相比，相应时间点Lv-PON1+敌敌畏组肝组织PON1 mRNA和PON1蛋白表达均明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05）。 (3).与正常对照组相比，敌敌畏染毒组在染毒后6h、12h、24h血清AChE活力明显受到抑制(P＜0.05）及6h、12h、24h、48h ALT、AST活力均明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05）;与敌敌畏染毒组相比，相应时间点Lv-PON1+敌敌畏组的血清AChE活力抑制程度明显减轻(P＜0.05)，ALT、AST活力明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，Lv-GFP+敌敌畏组的各项指标均无明显差异(P＞0.05)。 (4).与正常对照组相比，敌敌畏染毒组在染毒后6h、12h、24h小鼠肝组织SOD活力及6h、12h、24h CAT活力和GSH含量均明显降低(P＜0.05），6h、12h、24h、48h小鼠肝组织MDA含量显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，6h、12h肝组织Nrf2mRNA表达略有下降，随时间延长Nrf2mRNA表达逐渐升高(P＜0.05);与敌敌畏染毒组相比，Lv-PON1+敌敌畏组在6h、12h、24h、48h SOD活力、GSH含量明显升高及6h、12h、24h CAT活力明显升高(P＜0.05)，6h、12h、24h、48h MDA含量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，Nrf2mRNA表达明显升高(P＜0.05)，Lv-GFP+敌敌畏组的各项指标均无明显差异(P＞0.05)。 (5).与正常对照组相比，敌敌畏染毒组6h、12h、24h、48h小鼠肝组织NF-κBp65表达水平和TNF-α、IL-1β水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与敌敌畏染毒组相比，Lv-PON1+敌敌畏组在6h、12h、24h、48h小鼠肝组织TNF-α水平的升高程度均有所下降，6h、12h、24h IL-1β水平和NF-κBp65表达也显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，48h IL-1β和NF-κBp65无统计学差异(P＞0.05)，Lv-GFP+敌敌畏组的各项指标均无明显差异(P＞0.05)。 结论: (1).PON1下调可能参与敌敌畏中毒诱导的肝损伤过程。 (2).调控PON1基因可以减轻敌敌畏急性中毒导致的肝损伤。 (3).调控PON1基因可以缓解血清AChE活力的抑制;并可能通过启动Nrf2抗氧化程序，增强抗氧化能力;下调NF-κBp65水平，减少炎症因子释放，减轻敌敌畏中毒导致的肝损伤。