研究背景和目的肝癌的发病率及死亡率在全球范围内呈上升趋势。肝癌是全球第六大癌症,在2018年导致约78万人死亡,而且肝癌的预后很差,其5年生存率只有18.4%。肝细胞癌（HCC）约占肝癌病例的75-85%,多种病因如病毒性肝炎、酒精性肝炎和脂肪性肝炎均与肝癌有关。除了环境因素外,包括组蛋白修饰在内的多种遗传或表观遗传改变也是导致HCC发生的原因。虽然近年来随着治疗手段的不断改进,但HCC患者的预后仍不能令人满意。因此,临床上急切需要寻找新的治疗靶点及生物标志物,用于HCC患者的早期诊断、早期治疗及预后分类,以期提高患者的生存时间,并降低患者的死亡率及治疗费用。沉默信息调节因子（silent information regulators,SIRTs）是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶,调控许多细胞过程,如增殖、凋亡和代谢等。哺乳动物体内也已鉴定出多个Sirtuins基因,包括7个成员SIRT1–7。相关研究表明,SIRTs基因参与多种癌症的发生、预后、转移和化学耐药,这些基因通过肿瘤抑制因子或致癌因子的去乙酰化起作用。但目前SIRTs在HCC中的研究较少,具体的作用机制尚有待进一步的研究。因此,探讨SIRTs在HCC癌组织中的表达情况及其与HCC患者预后的关系具有重要的临床意义。在本研究中,我们首先利用公共数据库分析SIRTs家族在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况,并且分析SIRTs的表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系。然后,我们利用本单位的HCC患者术后的临床病理标本检测SIRTs家族在癌组织及癌旁组织中的表达水平,进而阐明SIRTs家族在HCC中的表达特性。通过以上研究发现SIRT7高表达与HCC患者的临床预后密切相关后,我们进一步使用HCC组织芯片验证SIRT7异常表达与HCC患者临床病理特征及预后的关系。研究方法1.公共数据库:使用Oncomine数据库（https://www.oncomine.org/resource/login.html）和GEPIA网站（http://gepia.cancer-pku.cn）分析SIRTs家族在HCC癌组织及正常组织中的表达情况。然后使用TCGA数据库（https://www.tcga.org）、GO数据库（http://geneontology.org）及KEGG数据库（https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html）等分析探讨这些SIRTs与HCC患者临床病理特征及预后的关系,同时探讨它们的代谢途径和功能富集,并利用STRING数据库（https://string–db.org/）构建SIRTs家族的蛋白-蛋白互作网络来探讨SIRTs之间的相互作用关系。2.临床标本:收集来源于2018年11月至2020年12月在本单位首次行肝癌切除术的30例HCC患者（男22例,女8例）的癌组织及癌旁组织标本,纳入标准为术后病理活检为HCC的患者。3.免疫组化:免疫组化采用S-P法。应用双半定量评分法判定免疫组化染色结果,评分标准如下:染色强度（0.未染色;1.弱染色;2.中度染色3.强染色）,染色阳性细胞率（0,≤5%;1,6%-25%;2,26%-50%;3,51%-75%;4,＞75%）。染色强度评分与染色阳性细胞率评分相乘得到的数值即为染色评分结果值。4.RNA提取、反转录及实时定量PCR:RNA应用TRIzol试剂提取,采用Takara反转录试剂盒对RNA进行反转录,应用SYBR法在Light Cycler480 II实时荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR（q PCR）反应。5.构建肝癌小鼠模型:使用雄性C57BL/6J小鼠出生后2天单次皮下注射200μg链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）,4周龄后自由喂养高脂饮食（High-fat diet,HFD）诱导NASH-HCC模型。24周后处死小鼠,取肝组织和血清标本作进一步分析。6.肝癌组织芯片验证:HCC组织芯片购自辽鼎生物科技有限公司（产品目录号:LD-LVC1603）,该芯片共含有135例HCC患者的癌组织及其相对应的癌旁正常组织样本。去除失访和组织芯点不完整的病例,共有124例患者纳入研究。7.统计学分析:所有的统计学分析都使用SPSS23.0（SPSS Inc,IL,USA）软件及Graph Pad Prism V8.0软件完成。应用卡方检验分析SIRTs家族在HCC癌组织及癌旁组织中的差异表达。采用非参数检验统计SIRTs表达与临床病理特征之间的关系,其中两组比较采用Manner-Whitney U检验,多组比较采用Kruskal-Wallis H检验。采用Kaplan–Meier法计算无病生存期及总生存期,并使用log-rank检验评估差异。计量资料结果采用均数±标准差（Mean±SD）或中位数（P25,P75）进行描述,计数资料采用百分比进行描述,P＜0.05为差异具有显著性。结果1.生物信息学工具分析SIRTs在HCC中的表达情况:基于TCGA及GEPIA数据库进行表达分析提示,与正常组织比较,SIRT2/3/4/6/7在肝癌组织中高表达,而SIRT1/5无表达差异。2.利用GO及KEGG数据库进行代谢及通路富集分析,并构建PPI网络:分析结果提示SIRTs在生物过程（BPS）、细胞成分（CCS）和分子功能（MFS）方面表现出相似性。KEGG通路分析提示SIRT1及SIRT2主要在核糖体、蛋白酶体和亨廷顿病中富集,SIRT3主要在核糖体、蛋白酶体和氧化磷酸化代谢通路中富集,SIRT5主要在机动蛋白骨架的调节及过氧化物酶代谢通路中富集,SIRT4/6/7主要富集于核糖体中。多基因富集结果显示SIRTs主要在烟酸盐和烟酰胺代谢、癌症的中心碳代谢及依赖NAD的蛋白去乙酰化等过程中富集。PPI蛋白-蛋白互作网络分析提示,肝脏疾病相关基因与SIRTs功能显著相关。其中部分基因与肿瘤的形成有关。3.SIRTs差异表达与HCC患者预后的关系:使用TCGA数据分析提示SIRT3（P=0.003）、SIRT6（P=0.001）和SIRT7（P＜0.001）m RNA高表达与HCC患者较短的总生存期（OS）显著相关,而SIRT1/2/4/5与HCC患者预后无显著相关性。同时,使用TCGA数据库分析提示SIRT3/6/7表达水平与肿瘤分期及病理分型相关。4.构建肝癌小鼠模型验证SIRT3/6/7在HCC中的表达情况:结果提示肝癌组织中SIRT3/6/7在m RNA和蛋白水平上均显著上调,且HFD/STZ模型组病理变化与肝细胞癌一致。5.临床样本验证SIRT3/6/7在HCC中的表达情况:结果显示SIRT3/6/7在HCC癌组织中的表达水平明显高于相邻正常组织。6.利用TCGA数据分析SIRTs差异表达与HCC患者预后的关系:分析结果表明SIRT7高表达可能是HCC患者预后不良的独立危险因素,而SIRT3/6与HCC患者的预后无显著相关。7.HCC组织芯片验证SIRT7差异表达与HCC患者预后的关系:结果提示SIRT7在HCC癌组织中,有68例（54.8%）高表达,主要位于细胞核中,且HCC癌组织中SIRT7的高表达率明显高于正常组织。在正常组织中以低表达或不表达为主,只有12例（17.8%）呈高表达。单因素分析结果表明肿瘤数目越多、肿瘤直径越大、术中出血量越多及SIRT7高表达是HCC患者术后复发的危险因素（P＜0.05）。多因素分析结果提示术中出血量越多（HR=1.001,95%CI:1.000-1.001,P=0.003）和SIRT7（HR=3.104,95%CI:1.697-5.678,P＜0.001）高表达是HCC患者术后DFS率较短的独立危险因素。肿瘤直径越大（HR=1.066,95%CI:1.009-1.127,P=0.022）、肿瘤数目越多（HR=2.088,95%CI:1.301-3.352,P=0.002）、有腹水（HR=2.981,95%CI:1.794-4.952,P＜0.001）及SIRT7高表达（HR=1.949,95%CI:1.239-3.065,P=0.004）是HCC患者术后OS较短的独立危险因素。结论1.除了SIRT1及SIRT5外,其他SIRTs家族成员在肝细胞癌组织中高表达。SIRT3/6/7的高表达与HCC患者的肿瘤分期、病理分级及不良预后明显相关,而SIRT1/2/4/5与HCC患者的肿瘤分期、病理分级及不良预后无明显相关。2.SIRT7高表达可能是HCC患者预后不良的独立危险因素。创新点1.本研究使用生物信息学工具初次系统阐述了SIRTs家族成员在HCC中的表达情况及其与HCC患者临床病理特征及预后的关系。2.初次构建肝癌小鼠模型验证SIRT3/6/7在HCC中的表达情况。3.初次结合生物信息学并利用组织芯片验证提出“SIRT7高表达可能是HCC患者预后不良的独立危险因素”的观点。