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目的:本研究利用结直肠癌高表达Her2的特性,构建靶向结直肠癌的CAR-T外泌体药物递送系统,负载miR-145和anti-PDL1,以实现对结直肠癌的靶向给药和基因、免疫联合治疗的目的。方法:（1）Her2慢病毒的包装、浓缩和滴度测定:将Her2目的质粒与p SPAX2、p MD2.G质粒按照不同比例在293T细胞中进行病毒包装,收集上清液,超速离心法对病毒进行浓缩,然后感染293T细胞,通过荧光法计算病毒滴度,摸索出病毒包装的最佳比例。（2）CAR-T细胞的构建:从血液中提取单核细胞,流式细胞仪分选出CD3+T细胞,Her2慢病毒感染T细胞（CHer2-T细胞）,并检测Her2的表达;此外将miR-145转染到CHer2-T细胞（CHer2-145-T细胞）,PCR检测miR-145的表达。（3）工程化CAR-T外泌体的构建:超速离心法提取CAR-T细胞外泌体（CHer2-exo、CHer2-145-exo）,化学偶联法将anti-PDL1偶联到CAR-T细胞外泌体上（CHer2-145-exo-a PDL1）,Gly-PLGLAG-Cys多肽（MMP-2/9敏感多肽）作为a PD-L1与CAR-T外泌体之间的连接器,该多肽可被肿瘤微环境（TME）中高表达的MMP-2/9切割,通过透射显微镜、马尔文粒径仪、Western blot对工程化CAR-T细胞外泌体进行表征,荧光共定位技术评估anti-PDL1的偶联效果。（4）细胞水平:通过MTT实验、划痕实验、Transwell实验、流式细胞实验研究工程化CAR-T外泌体对结直肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭、细胞周期及细胞凋亡的影响,通过PCR、Western blot实验研究相关的分子机制。（5）动物水平:选择C57BL/6小鼠构建结直肠癌异位瘤模型,小动物成像研究工程化CAR-T外泌体的体内靶向性,通过监测肿瘤体积和小鼠体重评估CAR-T外泌体对结直肠癌的治疗作用及其体内生物安全性。结果:（1）通过对Her2慢病毒进行包装、浓缩和滴度测定,摸索出Her2目的质粒与包装质粒（p SPAX2、p MD2.G）的最佳比例为4:2:1,病毒滴度为8×10~7TU/m L。（2）流式细胞仪检测CAR-T细胞中Her2蛋白的表达明显上调,阳性表达率为38.6%,PCR检测miR-145的表达显著增高,说明工程化CAR-T细胞的成功构建。（3）超速离心法分离工程化CAR-T外泌体,并对其进行表征:工程化CAR-T外泌体的形态呈典型的“圆碟”状,CHer2-exo的尺寸约为100nm,CHer2-145-exo的尺寸约为150nm,CHer2-145-exo-a PDL1的尺寸为206nm左右;Western blot显示工程化CAR-T外泌体高表达CD63、CD81,表明工程化CAR-T外泌体靶向递送系统的成功制备。（4）细胞水平:MTT实验、伤口愈合实验、Transwell实验的结果表明CHer2-145-exo-a PDL1可以明显地抑制HCT-116细胞的增殖、迁移与侵袭（P＜0.05）;PCR结果表明CHer2-145-exo-a PDL1组的miR-145的表达量明显高于Control组（P＜0.01）;流式细胞仪检测的细胞周期结果是:CHer2-145-exo-a PDL1组的G1期明显增高,G2期明显降低（P＜0.05）;并且凋亡结果显示,与Control组相比,CHer2-145-exo-a PDL1组明显促进HCT-116细胞的凋亡（P＜0.05）;Western blot结果表明,与Control组相比,CHer2-145-exo-a PDL1组的CCNE2的表达明显下调（P＜0.05）。（5）动物水平:小动物成像结果表明CHer2-exo可以有效地在肿瘤部位富集,说明CHer2-exo具有良好的靶向性;小鼠体重和HE结果表明工程化CAR-T外泌体在体内具有良好的生物安全性,肿瘤体积的结果表明工程化CAR-T外泌体可以显著地抑制结直肠癌的生长（P＜0.05）。结论:（1）成功构建了CAR-T外泌体靶向药物递送系统。（2）细胞实验证实工程化CAR-T外泌体对结直肠癌细胞的特异靶向性以及对细胞的增殖、迁移与侵袭有抑制作用,而这一过程与CCNE2蛋白密切相关。（3）体内实验证明工程化CAR-T外泌体具有很好的靶向性,对结直肠癌有明显的抑制作用,同时在体内具有良好的生物安全性。