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目的:稳定获得大量c-kit表型小鼠心脏干细胞(cardiacstemcells,CSCs),观察其生物学特性,诱导其向心肌样细胞分化,并探讨其是否有分化为窦房结样细胞的潜能。 方法:1、原代CSCs的分离、培养及传代:取2～3周体重10～15g昆明小鼠,雌雄不拘。麻醉后颈椎脱臼处死、消毒无菌条件下开胸暴露心脏,在解剖显微镜下分别取下心房和部分心室肌组织,分为心房组和心室组。通过心肌组织块贴壁培养法分别培养两组组织块,获取原代小鼠CSCs,观察心脏不同部位组织块中的CSCs“爬”出时间和增殖能力差异。待CSCs长满约70％～80%培养皿底时,用0.2%胰酶轻柔差速消化,收集消化液后加入CEM培养基中和胰酶,离心后弃上清,加入CEM重悬后传代备用。2、组织块共培养法诱导CSCs的体外分化:收集消化备用的CSCs分两部份,一部份传代贴壁1天后行免疫荧光检测CSCs特异性标志物c-kit,以及心肌细胞标志物:ɑ辅肌动蛋白(α-Actinin)、心肌特异性肌钙蛋白I(cardiacTroponin-I,cTnI)、心肌特异性肌钙蛋白T(cardiacTroponin-T,cTnT)的表达情况。另一部份分为A、B两组:A组采用Transwell小室与心肌组织块共培养、B组为无组织块共培养的对照组。共培养10天后,分别用免疫荧光染色检测A、B两组细胞的CSCs特异性标志物c-kit,以及α-Actinin、cTnI、cTnT,并且通过全细胞膜片钳技术检测各组细胞是否可记录到If电流。 结果:1、心肌组织块贴壁2天后可见成纤维细胞长出,心房组:4.92±0.88天开始“爬”出CSCs;而心室组:CSCs“爬”出时间为6.27±1.08天,经秩和检验P<0.05。两组细胞形态均呈圆形、胞质折光度好,分散附着于成纤维细胞上。心房组CSCs约15.23±1.58天融合至70～80%可传代,而心室组17.35±1.68天后融合至70～80%可传代,经秩和检验P>0.05。免疫荧光结果显示两组分别有94.7%和95.3%的圆、亮、胞质折光度好的细胞c-kit染色阳性。2、CSCs传代贴壁后1天,免疫荧光结果示心肌细胞标志物阳性率分别为α-Actinin34%、cTnI58.8%、cTnT45.5%。共培养10天后,A组部分圆形、折光度好的细胞增殖明显,有聚集生长趋势。且部分胞质折光度好的细胞逐渐向棒状、梭形、分支杆状的幼稚心肌细胞样形态转变。B组CSCs数量逐渐减少,且细胞形态逐渐由圆、亮变化为长梭形、条状的成纤维样细胞。免疫荧光结果示各组细胞心肌细胞标志物阳性率分别为,A组:α-Actinin87.0%、cTnI81.5%、cTnT80.5%(n=200);B组:α-Actinin76.5%、cTnI71.5%、cTnT70.0%(n=200)。统计结果显示:A、B两组间各心肌特异性标志物统计结果经x2检验,P值均小于0.05。且以上标记物免疫荧光强度A组均强于B组细胞。全细胞膜片钳分别成功封接到8个原代CSCs、12个A组和11个B组折光度好的细胞,并对其进行If电流(funnycurrent)检测,结果A组记录到If电流,而原代和B组均未记录到If电流。 结论:1、心肌组织块贴壁法可稳定获得大量c-kit阳性CSCs。2、心脏组织中,心房组织比心室组织块更早培养出CSCs。3、CSCs与心肌组织块共培养可被诱导分化为窦房结样细胞。