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研究背景及目的：
胶质瘤被定义为由胶质细胞或其前体细胞产生的任何肿瘤，包括星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，室管膜瘤，混合胶质瘤和其他更罕见的组织学类型。其中胶质母细胞瘤(GBM)在成年人脑肿瘤中是最常见的原发性恶性肿瘤之一，在美国平均每年发病率为3~10/10万人[1]。胶质母细胞瘤由世界卫生组织(WHO)归类为IV级，预后极差，其中位生存期为14.6~16个月[2,3]，5年生存率仅为3.4％[4]。新诊断的胶质母细胞瘤的标准一线治疗方案涉及多种方式，包括手术切除、放射治疗和替莫唑胺辅助性化学治疗[2]。即使在早期应用手术切除和放化疗，但几乎所有病人的肿瘤最终都会复发，复发后2年生存率仅有26％[2]。目前对复发性的脑胶质细胞瘤没有较好的治疗方法。因此，寻找新的脑胶质细胞瘤的治疗途径就显得特别重要。近年来，随着肿瘤相关基因逐渐深入的研究及分子生物学的发展，生物免疫治疗以及分子靶向药物的治疗已经成为肿瘤治疗的新方向。其中最为重要的就是针对不同的肿瘤如何选择其特异性的分子治疗靶点，这值得进一步探讨。
在肿瘤的演变过程中，肿瘤微环境扮演着不可替代的作用[5]。肿瘤微环境中除了肿瘤细胞外，主要有免疫调节性T细胞(Tregs)、髄源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)及成纤维细胞等，另外还存在多种免疫抑制因子，其在恶性肿瘤的进展过程中均发挥着重要的作用。其中大量的研究结果证明趋化因子和趋化因子受体相互作用，亦与肿瘤的进展密切相关[6-9]。趋化因子包括4个家族：CC家族、CXC家族、CX3C和C家族，其中C–Cchemokineligand8(CCL8)(MCP-2)属于CC家族，其特点是氨基酸序列中4个半胱氨酸残基形成2个相邻的二硫键，蛋白前体包含109个氨基酸，可趋化和激活多种不同类型的免疫细胞，如单核细胞、T细胞和NK细胞等。已经被报道为一种CCR5激动剂，它和CCL3(MIP-1a)在与受体结合的亲和力上类似，CCL8与CCR5结合后能够刺激受体内化和细胞内钙释放。已经有研究表明，在肺癌中，CCL8通过招募CCR5+Treg细胞到肿瘤部位，进一步促进肿瘤进展[10]；在恶性黑色素瘤患者中，CCL8也能够促进肿瘤的发生及发展[11]。目前，CCL8在脑胶质瘤中的表达情况尚未被探讨，在脑胶质瘤进展过程中发挥的作用及相应的分子机制还不清楚。
最近，相关研究发现，microRNA(miRNA)是一种单链非编码小分子RNA，在进化过程中高保守，已经在几种人类癌症中被确定为有希望的免疫治疗靶点[12-14]。miRNA很短，内源的单链RNA转录后，通过结合到靶信使RNA(mRNAs)的3-非翻译区(3-UTR)的互补序列上，抑制靶基因的表达[15]。miRNA参与控制许多重要的细胞功能，包括细胞血管生成、增殖、凋亡和侵袭，并在许多人类癌症中失调[16-19]。越来越多的研究证明：microRNA能够调节趋化因子的表达，从而进一步影响患者疾病的进展及预后[20-22]；还有研究表明：microRNA-181能够通过靶向YinYang1(YY1)而抑制子宫颈癌的进展[23]。而miR181在脑胶质瘤中的表达，其与CCL8表达水平的相关性，以及在脑胶质瘤进展中所发挥的作用尚未被研究。
本文通过研究miR181及CCL8在脑胶质瘤患者中的表达、功能及其相关性在脑胶质瘤进展中所发挥的作用；以及miR181是否能够抑制CCL8的表达，并抑制CCL8所促进的肿瘤细胞增殖及侵袭能力，对其相关机制进行研究。
第一部分CCL8在脑胶质瘤患者中的表达情况及其临床意义
方法
1)用RealtimePCR的方法检测趋化因子CCL8、CXCL1、CCL21、CCL19在脑胶质瘤组织及癌旁组织中的表达水平。
2)用RealtimePCR的方法检测CCL8和CXCL1与Tregs中CD4及FOXP3的表达，并进行相关性分析。
3)流式检测脑胶质瘤患者组织浸润的tregs细胞的比例及RealtimePCR的方法检测CCL8mRNA的表达，并分析两者之间是否具有相关性。
4)分析脑胶质瘤患者肿瘤组织中CCL8mRNA的表达水平同临床资料的相关性。
5)分析CCL8mRNA的表达与脑胶质瘤患者预后的相关性。
6)qRT-PCR检测脑胶质瘤细胞系中CCL8mRNA的表达水平。
结果
1)CCL8及CXCL1mRNA在脑胶质瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织，P＜0.05；CCL21和CCL19mRNA在脑胶质瘤癌组织中的表达水平低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2)脑胶质瘤患者肿瘤组织中CCL8的表达水平与Treg细胞中CD4及FOXP3的表达均呈现明显正相关关系(P＜0.05)；而CXCL1与Treg细胞中CD4及FOXP3的表达无明显相关性(P＞0.05)。
3)脑胶质瘤患者肿瘤浸润的tregs细胞的比例与同一批患者中CCL8mRNA的表达水平呈现明显的正相关关系(P＞0.05)。
4)肿瘤最大径≥5、低级别的及KPS评分＜70的肿瘤病人中，CCL8的表达相对于肿瘤最大径＜5、高级别的及KPS评分≥70的患者明显增高(P＜0.05)，而CCL8的表达水平与患者的年龄及性别无相关性(P＞0.05)。
5)CCL8低表达组患者的总生存率显著高于CCL8高表达组(P＜0.05)
6)所应用的脑胶质瘤细胞系中均有不同程度的CCL8mRNA的表达，其中在U87细胞系中表达最高，在U251和A172中的表达相对比较低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
小结
1)脑胶质瘤组织中CCL8mRNA的表达水平显著高于癌旁组织，CCL8可作为脑胶质瘤患者预后的一个指标。
2)在脑胶质瘤患者中，CCL8的表达与Treg细胞中CD4及FOXP3的表达呈现明显正相关关系，并且与患者的临床病理参数及预后明显相关,提示CCL8在脑胶质瘤患者中是一个恶性指标，在脑胶质瘤的恶性行为中可能发挥着重要作用。
第二部分CCL8的表达在脑胶质瘤细胞株中的功能分析
方法
1)构建敲低CCL8的U87脑胶质瘤细胞系，qRT-PCR检测CCL8mRNA的表达水平。
2)CCK8试剂盒检测敲低CCL8后对脑胶质瘤细胞系U87增殖能力的影响。
3)低粘附板用以观察CCL8敲低后脑胶质细胞成球能力的改变用以观察CCL8对细胞自我更新能力的影响。
4)Transwell实验用以观察CCL8表达降低后对细胞系U87侵袭能力的影响。
5)观察化疗药物替莫唑胺以不同浓度(0，12.5uM，25uM，50uM)、不同作用时间(0，1day，2day，3day)对U87细胞增殖能力的影响。
6)在最佳时间点及浓度下，观察化疗药物替莫唑胺对CCL8表达的影响。
7)通过Transwell实验，观察替莫唑胺对CCL8招募Treg细胞数量的影响。
8)通过Transwell实验，观察替莫唑胺对CCL8招募外周血单个核细胞中Treg细胞比例的影响。
结果
1)qRT-PCR检测CCL8敲低的效率，即CCL8在mRNA水平上表达明显降低(P＜0.05)。
2)CCK8试剂盒检测细胞增殖能力，CCL8敲低后U87细胞的增殖能力明显下降(P＜0.05)。
3)敲低CCL8的表达后，U87细胞的成球能力明显下降(P＜0.05)。
4)沉默掉CCL8，脑胶质瘤细胞系U87侵袭能力明显降低(P＜0.05)。
5)替莫唑胺能够明显降低脑胶质瘤细胞系U87的增殖能力并存在一种剂量依赖性的关系；并且在替莫唑胺浓度为12.5uM、作用2天时，细胞系U87的增殖能力明显下降(P＜0.05)。
6)在替莫唑胺浓度为12.5uM、作用脑胶质瘤细胞系U872天，检测CCL8的表达水平明显降低(P＜0.05)。
7)加入替莫唑胺后，通过计数观察被招募到下室的Tregs细胞的数量明显低于未加替莫唑胺组(P＜0.05)。
8)通过流式检测发现加入替莫唑胺后，被招募到下室中Tregs细胞占PBMC的百分比明显下降(P＜0.05)。
小结
1)敲低CCL8的表达后，脑胶质瘤细胞系U87的增殖能力、自我更新能力及侵袭能力明显下降，提示CCL8在脑胶质瘤细胞的恶性行为中发挥着重要的作用。
2)用替莫唑胺作用于脑胶质瘤细胞系U87后，U87细胞的增殖能力明显下降，同时CCL8的表达水平下调及Tregs细胞被招募到下室的数量减少，提示替莫唑胺对脑胶质瘤的有效性，并可通过免疫调节作用而产生抗肿瘤效果。
第三部分脑胶质瘤中miR181抑制CCL8的表达及功能分析
方法
1)通过TargetScanHuman7.1软件预测靶向CCL8的microRNA。
2)qRT-PCR检测miR181及miR4262在脑胶质瘤组织及癌旁组织中的表达水平，并比较在不同分级的脑胶质瘤组织中miR181的表达水平。
3)qRT-PCR检测miR181mRNA在脑胶质瘤细胞系中的表达水平。
4)qRT-PCR检测U87细胞系转染miR181的mimics后，miR181表达水平的变化。
5)利用双荧光素酶报告系统验证miR181与CCL8的靶向调控关系。
6)脑胶质瘤细胞系U87转染miR181后，检测CCL8mRNA的表达水平的改变。
7)低粘附板用以观察U87细胞系转染miR181的mimics后，U87细胞系自我更新能力的改变。
8)Transwell实验用以观察转染miR181的mimics后，细胞系U87侵袭能力的影响。
9)CCK8试剂盒检测转染miR181后对脑胶质瘤细胞系U87增殖能力的影响。
10)qRT-PCR检测miR181及CCL8mRNA在脑胶质瘤组织中的表达，并分析两者的相关性。
11)通过Transwell实验，检测转染miR181对Tregs细胞趋化的数量的影响。
12)通过Transwell实验，检测转染miR181对外周血单个核细胞中Tregs细胞趋化的比例的影响。
结果
1)通过TargetScanHuman7.1软件预测靶向CCL8的microRNA有miR181及miR4262。
2)RealtimePCR结果表明miR181mRNA在脑胶质瘤组织中的表达水平显著低于癌旁组织中的表达水平，并且因肿瘤组织分级水平的增加，miR181的表达情况会相应逐渐减少(P＜0.05)；而miR4262mRNA在脑胶质瘤组织及癌旁组织中的表达水平无显著差异(P＞0.05)。
3)miR181在脑胶质瘤细胞系U251、U87及A172中有不同程度的表达水平，其中在U87中表达水平最低，而在U251及A172中有较高的表达水平(P＜0.05)。
4)U87转染miR181的mimics后，miR181在mRNA水平上表达明显上升(P＜0.05)。
5)双荧光素酶报告检测发现，miR181可以直接结合CCL8的3，-UTR区。
6)U87成功转染miR181后，通过RealtimePCR检测CCL8mRNA的表达水平显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
7)通过低粘附板检测miR181转染后肿瘤细胞自我更新能力的变化，发现miR181能够显著降低肿瘤细胞的成球能力，也即能够降低肿瘤细胞的自我更新能力(P＜0.05)。
8)通过Transwell实验证明miR181能够明显降低肿瘤细胞的侵袭能力(P＜0.05)。
9)通过CCK8试剂盒证明miR181能够明显降低肿瘤细胞的增殖能力(P＜0.05)。
10)miR181与CCL8在mRNA水平上，呈现明显的负相关关系(P＜0.05)。
11)相对于对照组，U87细胞在转染miR181后对Tregs细胞的招募能力明显下降(P＜0.05)。
12)U87转染miR181后，被招募到下室的Tregs细胞占PBMC的比例明显低于对照组(P＜0.05)。
小结
1)转染miR181后，能够明显降低脑胶质瘤细胞系U87的增殖、自我更新、侵袭以及对Tregs细胞的招募能力，提示miR181在脑胶质瘤细胞的恶性行为中发挥着重要的作用。
2)脑胶质瘤细胞系U87转染miR181后，肿瘤细胞中CCL8的表达水平明显降低；miR181与CCL8的表达水平在脑胶质瘤组织中呈现明显负相关性；miR181能够明显抑制肿瘤的生长体积以及抑制CCL8的表达以进一步抑制对tregs细胞的招募作用。提示miR181能够负向调控CCL8的表达，以进一步影响脑胶质瘤患者的进展。
结论
1)CCL8在脑胶质瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织，并且能够促进脑胶质瘤细胞的增殖、自我更新、侵袭及对Tregs细胞招募能力。
2)miR181在脑胶质瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织，能够负向调控CCL8的表达，进一步抑制脑胶质瘤细胞的增殖、自我更新、侵袭及对Tregs细胞招募能力。
3)miR181和CCL8可以作为脑胶质瘤潜在的一个治疗靶点。
胶质瘤被定义为由胶质细胞或其前体细胞产生的任何肿瘤，包括星形细胞瘤，少突神经胶质瘤，胶质母细胞瘤，室管膜瘤，混合胶质瘤和其他更罕见的组织学类型。其中胶质母细胞瘤(GBM)在成年人脑肿瘤中是最常见的原发性恶性肿瘤之一，在美国平均每年发病率为3~10/10万人[1]。胶质母细胞瘤由世界卫生组织(WHO)归类为IV级，预后极差，其中位生存期为14.6~16个月[2,3]，5年生存率仅为3.4％[4]。新诊断的胶质母细胞瘤的标准一线治疗方案涉及多种方式，包括手术切除、放射治疗和替莫唑胺辅助性化学治疗[2]。即使在早期应用手术切除和放化疗，但几乎所有病人的肿瘤最终都会复发，复发后2年生存率仅有26％[2]。目前对复发性的脑胶质细胞瘤没有较好的治疗方法。因此，寻找新的脑胶质细胞瘤的治疗途径就显得特别重要。近年来，随着肿瘤相关基因逐渐深入的研究及分子生物学的发展，生物免疫治疗以及分子靶向药物的治疗已经成为肿瘤治疗的新方向。其中最为重要的就是针对不同的肿瘤如何选择其特异性的分子治疗靶点，这值得进一步探讨。
在肿瘤的演变过程中，肿瘤微环境扮演着不可替代的作用[5]。肿瘤微环境中除了肿瘤细胞外，主要有免疫调节性T细胞(Tregs)、髄源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)及成纤维细胞等，另外还存在多种免疫抑制因子，其在恶性肿瘤的进展过程中均发挥着重要的作用。其中大量的研究结果证明趋化因子和趋化因子受体相互作用，亦与肿瘤的进展密切相关[6-9]。趋化因子包括4个家族：CC家族、CXC家族、CX3C和C家族，其中C–Cchemokineligand8(CCL8)(MCP-2)属于CC家族，其特点是氨基酸序列中4个半胱氨酸残基形成2个相邻的二硫键，蛋白前体包含109个氨基酸，可趋化和激活多种不同类型的免疫细胞，如单核细胞、T细胞和NK细胞等。已经被报道为一种CCR5激动剂，它和CCL3(MIP-1a)在与受体结合的亲和力上类似，CCL8与CCR5结合后能够刺激受体内化和细胞内钙释放。已经有研究表明，在肺癌中，CCL8通过招募CCR5+Treg细胞到肿瘤部位，进一步促进肿瘤进展[10]；在恶性黑色素瘤患者中，CCL8也能够促进肿瘤的发生及发展[11]。目前，CCL8在脑胶质瘤中的表达情况尚未被探讨，在脑胶质瘤进展过程中发挥的作用及相应的分子机制还不清楚。
最近，相关研究发现，microRNA(miRNA)是一种单链非编码小分子RNA，在进化过程中高保守，已经在几种人类癌症中被确定为有希望的免疫治疗靶点[12-14]。miRNA很短，内源的单链RNA转录后，通过结合到靶信使RNA(mRNAs)的3-非翻译区(3-UTR)的互补序列上，抑制靶基因的表达[15]。miRNA参与控制许多重要的细胞功能，包括细胞血管生成、增殖、凋亡和侵袭，并在许多人类癌症中失调[16-19]。越来越多的研究证明：microRNA能够调节趋化因子的表达，从而进一步影响患者疾病的进展及预后[20-22]；还有研究表明：microRNA-181能够通过靶向YinYang1(YY1)而抑制子宫颈癌的进展[23]。而miR181在脑胶质瘤中的表达，其与CCL8表达水平的相关性，以及在脑胶质瘤进展中所发挥的作用尚未被研究。
本文通过研究miR181及CCL8在脑胶质瘤患者中的表达、功能及其相关性在脑胶质瘤进展中所发挥的作用；以及miR181是否能够抑制CCL8的表达，并抑制CCL8所促进的肿瘤细胞增殖及侵袭能力，对其相关机制进行研究。
第一部分CCL8在脑胶质瘤患者中的表达情况及其临床意义
方法
1)用RealtimePCR的方法检测趋化因子CCL8、CXCL1、CCL21、CCL19在脑胶质瘤组织及癌旁组织中的表达水平。
2)用RealtimePCR的方法检测CCL8和CXCL1与Tregs中CD4及FOXP3的表达，并进行相关性分析。
3)流式检测脑胶质瘤患者组织浸润的tregs细胞的比例及RealtimePCR的方法检测CCL8mRNA的表达，并分析两者之间是否具有相关性。
4)分析脑胶质瘤患者肿瘤组织中CCL8mRNA的表达水平同临床资料的相关性。
5)分析CCL8mRNA的表达与脑胶质瘤患者预后的相关性。
6)qRT-PCR检测脑胶质瘤细胞系中CCL8mRNA的表达水平。
结果
1)CCL8及CXCL1mRNA在脑胶质瘤组织中的表达水平显著高于癌旁组织，P＜0.05；CCL21和CCL19mRNA在脑胶质瘤癌组织中的表达水平低于癌旁组织，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
2)脑胶质瘤患者肿瘤组织中CCL8的表达水平与Treg细胞中CD4及FOXP3的表达均呈现明显正相关关系(P＜0.05)；而CXCL1与Treg细胞中CD4及FOXP3的表达无明显相关性(P＞0.05)。
3)脑胶质瘤患者肿瘤浸润的tregs细胞的比例与同一批患者中CCL8mRNA的表达水平呈现明显的正相关关系(P＞0.05)。
4)肿瘤最大径≥5、低级别的及KPS评分＜70的肿瘤病人中，CCL8的表达相对于肿瘤最大径＜5、高级别的及KPS评分≥70的患者明显增高(P＜0.05)，而CCL8的表达水平与患者的年龄及性别无相关性(P＞0.05)。
5)CCL8低表达组患者的总生存率显著高于CCL8高表达组(P＜0.05)
6)所应用的脑胶质瘤细胞系中均有不同程度的CCL8mRNA的表达，其中在U87细胞系中表达最高，在U251和A172中的表达相对比较低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
小结
1)脑胶质瘤组织中CCL8mRNA的表达水平显著高于癌旁组织，CCL8可作为脑胶质瘤患者预后的一个指标。
2)在脑胶质瘤患者中，CCL8的表达与Treg细胞中CD4及FOXP3的表达呈现明显正相关关系，并且与患者的临床病理参数及预后明显相关,提示CCL8在脑胶质瘤患者中是一个恶性指标，在脑胶质瘤的恶性行为中可能发挥着重要作用。
第二部分CCL8的表达在脑胶质瘤细胞株中的功能分析
方法
1)构建敲低CCL8的U87脑胶质瘤细胞系，qRT-PCR检测CCL8mRNA的表达水平。
2)CCK8试剂盒检测敲低CCL8后对脑胶质瘤细胞系U87增殖能力的影响。
3)低粘附板用以观察CCL8敲低后脑胶质细胞成球能力的改变用以观察CCL8对细胞自我更新能力的影响。
4)Transwell实验用以观察CCL8表达降低后对细胞系U87侵袭能力的影响。
5)观察化疗药物替莫唑胺以不同浓度(0，12.5uM，25uM，50uM)、不同作用时间(0，1day，2day，3day)对U87细胞增殖能力的影响。
6)在最佳时间点及浓度下，观察化疗药物替莫唑胺对CCL8表达的影响。
7)通过Transwell实验，观察替莫唑胺对CCL8招募Treg细胞数量的影响。
8)通过Transwell实验，观察替莫唑胺对CCL8招募外周血单个核细胞中Treg细胞比例的影响。
结果
1)qRT-PCR检测CCL8敲低的效率，即CCL8在mRNA水平上表达明显降低(P＜0.05)。
2)CCK8试剂盒检测细胞增殖能力，CCL8敲低后U87细胞的增殖能力明显下降(P＜0.05)。
3)敲低CCL8的表达后，U87细胞的成球能力明显下降(P＜0.05)。
4)沉默掉CCL8，脑胶质瘤细胞系U87侵袭能力明显降低(P＜0.05)。
5)替莫唑胺能够明显降低脑胶质瘤细胞系U87的增殖能力并存在一种剂量依赖性的关系；并且在替莫唑胺浓度为12.5uM、作用2天时，细胞系U87的增殖能力明显下降(P＜0.05)。
6)在替莫唑胺浓度为12.5uM、作用脑胶质瘤细胞系U872天，检测CCL8的表达水平明显降低(P＜0.05)。
7)加入替莫唑胺后，通过计数观察被招募到下室的Tregs细胞的数量明显低于未加替莫唑胺组(P＜0.05)。
8)通过流式检测发现加入替莫唑胺后，被招募到下室中Tregs细胞占PBMC的百分比明显下降(P＜0.05)。
小结
1)敲低CCL8的表达后，脑胶质瘤细胞系U87的增殖能力、自我更新能力及侵袭能力明显下降，提示CCL8在脑胶质瘤细胞的恶性行为中发挥着重要的作用。
2)用替莫唑胺作用于脑胶质瘤细胞系U87后，U87细胞的增殖能力明显下降，同时CCL8的表达水平下调及Tregs细胞被招募到下室的数量减少，提示替莫唑胺对脑胶质瘤的有效性，并可通过免疫调节作用而产生抗肿瘤效果。
第三部分脑胶质瘤中miR181抑制CCL8的表达及功能分析
方法
1)通过TargetScanHuman7.1软件预测靶向CCL8的microRNA。
2)qRT-PCR检测miR181及miR4262在脑胶质瘤组织及癌旁组织中的表达水平，并比较在不同分级的脑胶质瘤组织中miR181的表达水平。
3)qRT-PCR检测miR181mRNA在脑胶质瘤细胞系中的表达水平。
4)qRT-PCR检测U87细胞系转染miR181的mimics后，miR181表达水平的变化。
5)利用双荧光素酶报告系统验证miR181与CCL8的靶向调控关系。
6)脑胶质瘤细胞系U87转染miR181后，检测CCL8mRNA的表达水平的改变。
7)低粘附板用以观察U87细胞系转染miR181的mimics后，U87细胞系自我更新能力的改变。
8)Transwell实验用以观察转染miR181的mimics后，细胞系U87侵袭能力的影响。
9)CCK8试剂盒检测转染miR181后对脑胶质瘤细胞系U87增殖能力的影响。
10)qRT-PCR检测miR181及CCL8mRNA在脑胶质瘤组织中的表达，并分析两者的相关性。
11)通过Transwell实验，检测转染miR181对Tregs细胞趋化的数量的影响。
12)通过Transwell实验，检测转染miR181对外周血单个核细胞中Tregs细胞趋化的比例的影响。
结果
1)通过TargetScanHuman7.1软件预测靶向CCL8的microRNA有miR181及miR4262。
2)RealtimePCR结果表明miR181mRNA在脑胶质瘤组织中的表达水平显著低于癌旁组织中的表达水平，并且因肿瘤组织分级水平的增加，miR181的表达情况会相应逐渐减少(P＜0.05)；而miR4262mRNA在脑胶质瘤组织及癌旁组织中的表达水平无显著差异(P＞0.05)。
3)miR181在脑胶质瘤细胞系U251、U87及A172中有不同程度的表达水平，其中在U87中表达水平最低，而在U251及A172中有较高的表达水平(P＜0.05)。
4)U87转染miR181的mimics后，miR181在mRNA水平上表达明显上升(P＜0.05)。
5)双荧光素酶报告检测发现，miR181可以直接结合CCL8的3，-UTR区。
6)U87成功转染miR181后，通过RealtimePCR检测CCL8mRNA的表达水平显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
7)通过低粘附板检测miR181转染后肿瘤细胞自我更新能力的变化，发现miR181能够显著降低肿瘤细胞的成球能力，也即能够降低肿瘤细胞的自我更新能力(P＜0.05)。
8)通过Transwell实验证明miR181能够明显降低肿瘤细胞的侵袭能力(P＜0.05)。
9)通过CCK8试剂盒证明miR181能够明显降低肿瘤细胞的增殖能力(P＜0.05)。
10)miR181与CCL8在mRNA水平上，呈现明显的负相关关系(P＜0.05)。
11)相对于对照组，U87细胞在转染miR181后对Tregs细胞的招募能力明显下降(P＜0.05)。
12)U87转染miR181后，被招募到下室的Tregs细胞占PBMC的比例明显低于对照组(P＜0.05)。
小结
1)转染miR181后，能够明显降低脑胶质瘤细胞系U87的增殖、自我更新、侵袭以及对Tregs细胞的招募能力，提示miR181在脑胶质瘤细胞的恶性行为中发挥着重要的作用。
2)脑胶质瘤细胞系U87转染miR181后，肿瘤细胞中CCL8的表达水平明显降低；miR181与CCL8的表达水平在脑胶质瘤组织中呈现明显负相关性；miR181能够明显抑制肿瘤的生长体积以及抑制CCL8的表达以进一步抑制对tregs细胞的招募作用。提示miR181能够负向调控CCL8的表达，以进一步影响脑胶质瘤患者的进展。
结论
1)CCL8在脑胶质瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织，并且能够促进脑胶质瘤细胞的增殖、自我更新、侵袭及对Tregs细胞招募能力。
2)miR181在脑胶质瘤组织中的表达水平明显低于癌旁组织，能够负向调控CCL8的表达，进一步抑制脑胶质瘤细胞的增殖、自我更新、侵袭及对Tregs细胞招募能力。
3)miR181和CCL8可以作为脑胶质瘤潜在的一个治疗靶点。