肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC:以下简称肝癌）是原发性肝癌（Primary liver cancer,PLC）的主要类型,目前已成为全球性的重大公共卫生问题,也是全球第二大致死性恶性肿瘤。在中国,肝癌在所有肿瘤中发病率和死亡率均高居前列。由于缺乏良好的药物靶标和预后标志物,大多数肝癌患者就诊后仍发展为预后不良的晚期肝癌。因此,我们迫切需要探索肝癌的发生发展机制,为改善肝癌患者的治疗和预后寻找特异性药物靶标以及新的治疗策略。长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200 nt几乎没有编码蛋白质能力的RNA转录物;也是目前生物医学领域最热门的研究方向之一。LncRNA可以在多个层面参与调控广泛的生物学过程,并且lncRNA异常表达可能导致多种疾病甚至是肿瘤的发生。因此,发现和鉴定新的与肝癌发生发展相关的lncRNA并揭示其分子调控机制,将为肝癌患者的临床治疗及预后提供新的候选靶标。第一部分:长链非编码RNA ASLNC18342通过与PTBP1相互作用调控FGFR2的可变剪接促进肝癌的发展LncRNA可以在多个层面参与调控广泛的生物学过程,包括转录水平调控、转录后水平调控、表观遗传调控、蛋白功能和定位及胞间信号转导等。近几年,越来越多的报道显示lncRNA在肝癌的发生发展中发挥着至关重要的作用。我们课题组前期通过整合mRNA表达谱和lncRNA表达谱,采用Module map策略鉴定到了一个全新的肝癌相关lncRNA——ASLNC18342。我们发现ASLNC18342是一个转录活跃、编码能力低,长度为3329 nt、核定位的、3’端带有poly A序列的lncRNA。初步的功能研究证实ASLNC18342在肝癌细胞中发挥促癌功能。我们的研究目的是继续探究ASLNC18342促进肝癌细胞生长和转移的分子机制。在本研究中,我们首先通过体外功能实验进一步证实敲低ASLNC18342能够抑制肝癌细胞系MHCC97H的生长、迁移和侵袭能力;过表达ASLNC18342促进肝癌细胞系Huh7的生长、迁移和侵袭能力。本课题组前期通过RNA pull down结合质谱分析鉴定到与ASLNC18342的相互作用蛋白——PTBP1,并通过其他独立技术确证了ASLNC18342与PTBP1之间存在特异的相互作用。在本研究中,我们通过依赖性实验进一步证实了ASLNC18342促进肝癌细胞的生长、迁移和侵袭依赖于PTBP1。为了进一步揭示ASLNC18342-PTBP1 RNA-蛋白质机器发挥促癌功能的分子机制,我们对ASLNC18342 pull-down的蛋白进行功能富集分析。我们发现,与ASLNC18342相互作用的蛋白显著富集于调控FGFR2可变剪接（Alternative splicing,AS）的复合体集,其中包括PTBP1。我们采用RNA免疫沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）实验证实ASLNC18342能够增强PTBP1结合FGFR2前体mRNA的能力。其次,我们采用实时荧光定量PCR实验证实ASNLNC18342和PTBP1均可以调控FGFR2前体mRNA的可变剪接:抑制FGFG2-Ⅲb的表达、促进FGFR2-Ⅲc的表达。以上结果表明,ASLNC18342通过与PTBP1相互作用,参与调控了FGFR2的可变剪接。我们进一步发现FGFR2-Ⅲb向FGFR2-Ⅲc的转换在肝癌细胞中发挥促癌功能。FGFR2-Ⅲc在肝癌细胞中促进细胞的生长、迁移和侵袭;而FGFR2-Ⅲb在肝癌细胞中发挥抑癌功能。我们还发现,FGFR2-Ⅲb向FGFR2-Ⅲc的转换促进了肝癌细胞上皮-间质转化（Epithelial to mesenchymal transition,EMT）的发生。同时,FGFR2-Ⅲc显著促进了下游蛋白激酶B（Protein kinase B,AKT）和细胞外调节蛋白激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK）信号的激活;而FGFR2-Ⅲb发挥相反的作用。总之,在肝癌细胞中,ASLNC18342通过PTBP1促进了FGFR2前体mRNA的可变剪接,导致FGFR2-Ⅲb亚型向FGFR2-Ⅲc亚型转换,激活了AKT和ERK信号通路,从而促进肝癌细胞的生长、迁移和侵袭。第二部分:构建及评估基于干性相关lncRNA的肝癌预后预测模型肝癌患者预后生物标志物对于评估患者的生存率、选择治疗策略和确定临床试验等都非常重要。肿瘤中常用于指示预后的生物标志物有肿瘤大小、淋巴结数量和转移灶数量等。然而,这些临床病理指标的准确性有限。目前研发用于肝癌患者精确生存评估和治疗策略的确定的预后生物标志物研究进展甚微。干细胞（Stem cell,SC）是一类能够无限分裂和增殖并永久自我更新的细胞。研究人员发现肿瘤中存在一种肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）。它是一类特殊的具有干细胞特征的肿瘤细胞。这些细胞对化疗药物有天然耐药性,并具有自我更新、多向分化以及启动和重建肿瘤组织表型的能力。肝癌细胞向干细胞特征的转化与肝癌的进展密切相关。随着人们对肿瘤干细胞的研究,针对肿瘤干细胞的靶向治疗的策略也越来越多。在这项研究中,我们目的是建立一个基于肝癌细胞干性相关lncRNA的预后预测模型。我们期望通过此模型,鉴定与肝癌细胞干性相关的lncRNA,并探索这些lncRNA作为肝癌患者预后生物标志物的潜在价值。首先,我们基于肝癌细胞干性相关的lncRNA表达谱数据构建了肝癌预后预测模型。我们采用基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）分析和Spearman相关性分析,筛选到136个与肝癌干细胞（Liver cancer stem cell,LCSC）相关的lncRNA。我们采用单变量及多变量Cox比例风险回归分析进一步筛选出其中22个有独立预后价值的lncRNA。为了构建最佳预后风险模型,我们采用最小绝对收缩和选择算子（Least absolute shrinkage and selection operator,LASSO）回归分析建立了一个由11个lncRNA（AC008622.2、AC015908.3、AC020915.2、AC025176.1、AC026356.2、AC099850.3、CYTOR、DDX11-AS1、HTR2A-AS1、LINC02870和SNHG3）组成的预后预测模型。Kaplan-Meier生存分析显示,高风险组肝癌患者的总体生存率显著低于低风险组。此模型对肝癌患者1、3和5年生存的预测效能ROC曲线下面积（Area under the ROC curve,AUC）分别为0.772、0.694和0.703,显著优于其他的临床病理指标。此外,我们在另一个独立队列（GSE40144）中验证了此模型的预后预测能力。其次,我们系统评价了此模型与临床病理指标的相关性。我们通过单变量和多变量Cox回归分析证实此风险模型是肝癌重要的预后因素,独立于其他临床病理因素。通过风险评分与临床病理特征的相关性分析和分层生存分析,我们发现此预后风险模型是肝癌患者尤其是男性患者的一个重要的独立预后因素。为了进一步建立一种可用于预测肝癌患者生存率的临床相关定量方法,我们采用多变量Cox分析建立了基于风险模型评分以及临床病理指标在内的综合列线图。接下来,为了探究此预后模型风险评分潜在的生物学机制,我们采用功能富集分析系统评估了高、低风险组之间信号通路活性的差异。基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）显示,高风险组中显著富集了多种类型的癌症、细胞周期和DNA损伤相关的通路（如p53信号通路）;而低风险组主要富集了多条细胞代谢相关通路。最后,我们针对22个预后相关的lncRNA中风险预测能力最显著的SNHG12开展了功能验证研究。SNHG12在肝癌及大多数肿瘤组织中显著高表达,且其高标达与肝癌等多种肿瘤患者的不良预后显著相关。通过基因组、表观基因组和转录组整合分析,我们发现SNHG12在肝癌组织中高表达主要由其启动子区的DNA低甲基化所介导。随后,我们通过功能研究发现在肝癌细胞中敲低SNHG12显著抑制了肿瘤干细胞标志分子OCT4、NANOG和CD133的表达水平。与此一致的是,肝癌组织中SNHG12的表达水平与OCT4和CD133的表达水平显著正相关。此外,体外功能研究表明敲低SNHG12显著抑制肝癌细胞的生长、迁移和侵袭。总之,我们构建了一个由11个LCSC相关lncRNA组成的风险评分模型,该模型可准确预测肝癌患者的生存预后。同时,针对模型中干性相关候选lncRNA的功能机制研究有望为针对干细胞的临床治疗策略提供理论依据和候选靶标。