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背景
近年来，伴随着癌症患者放疗和化疗次数的增加，抗生素和免疫抑制剂使用的增长，艾滋病的传播等，导致深部真菌感染疾病的发病率、死亡率也显著增加。白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans, CA)属于条件致病菌，能造成深部真菌感染。目前临床上可供选择使用的抗真菌药物有限，其中唑类药物低毒、高效，被广泛用于抗真菌感染，但也因此导致耐药念珠菌的分离率不断增加。为对抗真菌耐药性，药物联合使用受到了广泛关注。氯尼达明(Lonidamine，LND)是一种抗肿瘤药物，抗癌谱广，副作用低，目前，它在临床上经常与其他抗肿瘤药物联合用于多种肿瘤疾病的治疗。其作用机制主要是抑制癌细胞的能量代谢，包括抑制癌细胞的氧耗以及糖酵解途径中己糖激酶的活性等来发挥抗肿瘤作用。另外，已有相关研究表明，糖代谢途径与白色念珠菌感染宿主的过程息息相关，其中糖酵解途径能为白色念珠菌在宿主的血浆与组织感染过程提供能量，且Ⅱ型己糖激酶(HXK2)与白色念珠菌的毒力因子有着密切联系。然而，现在尚未发现关于LND联合氟康唑(Fluconazole，FLC)针对白色念珠菌的研究。
目的
研究、评估LND联合FLC针对白色念珠菌在体外及体内的抗真菌作用，并进一步探讨潜在的药物协同抗真菌机制。
方法
在体外实验中，采用了微量肉汤稀释法测定LND单用或联合FLC对抗白色念珠菌浮游菌的最低抑菌浓度;使用了XTT比色实验判断LND联合FLC是否对白色念珠菌不同时间段形成的生物膜具有协同作用。通过使用CA10感染昆虫模型来评价LND联合FLC在体内抗真菌的效果，包括记录不同药物组中大蜡螟的存活数量、体内白色念珠菌的含量以及观察幼虫组织病理学的损伤程度。此外，为了进一步探索LND与FLC联用潜在的抗白色念珠菌机制，我们观察并拍摄了不同组药物对白色念珠菌在Spider培养基中生成菌丝的影响;也采用荧光探针DCFH-DA和FITC-VAD-FMK分别探究了药物联用对白色念珠菌内活性氧蓄积及半胱氨酸蛋白酶活性的影响;最后，通过使用试剂罗丹明6G检测了LND是否对白色念珠菌细胞膜上转运蛋白的功能有影响。
结果
(1)LND联合FLC能产生协同抗耐FLC白色念珠菌浮游细胞的作用
LND单用对实验用的12株白色念珠菌均无明显抗真菌作用，但当其与FLC联用后，对其中6株耐FLC菌株有协同抗真菌作用，其中FLC的MIC值能被明显降低:从≥512μg/mL降至0.5μg/mL，FICI值在0.06-0.13之间。同时，虽然对另外6株白色念珠菌敏感株，FICI＞0.5，LND与FLC联用无明显协同作用，但LND的最低抑菌浓度也能从≥512μg/mL降至32-64μg/mL。
(2)LND联合FLC能产生协同抗白色念珠菌生物膜的作用
实验结果表明，LND+FLC对抗预形成时间较短(≤8h)的白色念珠菌生物膜具有协同作用，其中FLC的生物膜最低抑菌浓度能由≥1024μg/mL被降低至2-8μg/mL，FICIs＜0.5。同时我们也观察到，虽然随着形成生物膜的时间延长，药物联用对白色念珠菌在12h和24h预形成的生物膜显示出无关作用，但当作用于预形成时间为12h的生物膜时，FLC的sMIC仍可被LND显著降低128-512倍，具有一定的意义。
(3)LND联合FLC在大蜡螟幼虫体内具有协同抗真菌作用
LND联合FLC使用在大蜡螟体内具有协同抗真菌作用，具体表现为与其它3组相比，LND-FLC药物联用时大大增加幼虫的存活数量，显著降低死亡率，且明显减少幼虫体内的白色念珠菌含量，同时，能显著减少组织中黑色菌块的大小、数量，仅有个别微小菌块散落于组织中，即能减弱对幼虫组织的损伤程度。
(4)LND联合FLC具有抑制耐药白色念珠菌菌丝的形态转变的作用
与对照组相比，FLC单用可略微减少菌丝的数量，但对菌丝长度无明显影响。LND单用可使白色念珠菌菌丝变短，数量无明显变化，且大多呈聚集状态。但LND联合FLC能使白色念珠菌在Spider培养基中的菌丝长度显著变短，数量也明显减少，且有圆形的酵母态细胞存在，即意味着LND+FLC能抑制CA10菌丝从酵母态到菌丝态的形态转换。
(5)LND联合FLC可以激活白色念珠菌胞内半胱氨酸蛋白酶，但不会引起活性氧蓄积
与对照组、药物单用组相比，LND-FLC联用组中的活性氧水平无明显升高或降低(P＞0.05)。此外，在显微镜下未观察到对照组与药物单用组中有荧光出现。然而，在LND+FLC组中，我们观察到，不仅真菌细胞数量明显减少，且发出了亮绿色荧光，表明了胞内半胱氨酸蛋白酶被激活，说明药物联用协同抗耐药白色念珠菌机制可能与激活真菌胞内半胱氨酸蛋白酶进而引起细胞凋亡有关。
(6)LND联合FLC抗耐药白色念珠菌的作用与抑制药物转运体的活性无关
药物外排基因的过表达是白色念珠菌耐药的最常见机制之一。本部分使用Rh6G替代FLC进行实验。结果表明，与control组相比，LND组中Rh6G的吸收和外排曲线几乎没有差异(P＞0.05)，这提示我们LND和FLC的协同抗真菌作用与抑制药物转运蛋白的活性无关。
结论
本研究发现了LND的一种新型药理作用，即LND联合FLC使用对白色念珠菌的浮游细胞及预形成时间较短(≤8h)的生物膜具有协同抗真菌活性。此外，我们通过机理研究实验进一步阐明了协同抗真菌作用可能与抑制生物膜的形成、菌丝形态转变及激活真菌胞内半胱氨酸蛋白酶有关，但与增加胞内活性氧水平及抑制药物转运体的活性无关，其他协同机制仍需进一步研究。本论文希望为克服真菌的耐药性和基于糖代谢通路寻找新型抗真菌药物提供理论基础。
近年来，伴随着癌症患者放疗和化疗次数的增加，抗生素和免疫抑制剂使用的增长，艾滋病的传播等，导致深部真菌感染疾病的发病率、死亡率也显著增加。白色念珠菌(Candida albicans，C.albicans, CA)属于条件致病菌，能造成深部真菌感染。目前临床上可供选择使用的抗真菌药物有限，其中唑类药物低毒、高效，被广泛用于抗真菌感染，但也因此导致耐药念珠菌的分离率不断增加。为对抗真菌耐药性，药物联合使用受到了广泛关注。氯尼达明(Lonidamine，LND)是一种抗肿瘤药物，抗癌谱广，副作用低，目前，它在临床上经常与其他抗肿瘤药物联合用于多种肿瘤疾病的治疗。其作用机制主要是抑制癌细胞的能量代谢，包括抑制癌细胞的氧耗以及糖酵解途径中己糖激酶的活性等来发挥抗肿瘤作用。另外，已有相关研究表明，糖代谢途径与白色念珠菌感染宿主的过程息息相关，其中糖酵解途径能为白色念珠菌在宿主的血浆与组织感染过程提供能量，且Ⅱ型己糖激酶(HXK2)与白色念珠菌的毒力因子有着密切联系。然而，现在尚未发现关于LND联合氟康唑(Fluconazole，FLC)针对白色念珠菌的研究。
目的
研究、评估LND联合FLC针对白色念珠菌在体外及体内的抗真菌作用，并进一步探讨潜在的药物协同抗真菌机制。
方法
在体外实验中，采用了微量肉汤稀释法测定LND单用或联合FLC对抗白色念珠菌浮游菌的最低抑菌浓度;使用了XTT比色实验判断LND联合FLC是否对白色念珠菌不同时间段形成的生物膜具有协同作用。通过使用CA10感染昆虫模型来评价LND联合FLC在体内抗真菌的效果，包括记录不同药物组中大蜡螟的存活数量、体内白色念珠菌的含量以及观察幼虫组织病理学的损伤程度。此外，为了进一步探索LND与FLC联用潜在的抗白色念珠菌机制，我们观察并拍摄了不同组药物对白色念珠菌在Spider培养基中生成菌丝的影响;也采用荧光探针DCFH-DA和FITC-VAD-FMK分别探究了药物联用对白色念珠菌内活性氧蓄积及半胱氨酸蛋白酶活性的影响;最后，通过使用试剂罗丹明6G检测了LND是否对白色念珠菌细胞膜上转运蛋白的功能有影响。
结果
(1)LND联合FLC能产生协同抗耐FLC白色念珠菌浮游细胞的作用
LND单用对实验用的12株白色念珠菌均无明显抗真菌作用，但当其与FLC联用后，对其中6株耐FLC菌株有协同抗真菌作用，其中FLC的MIC值能被明显降低:从≥512μg/mL降至0.5μg/mL，FICI值在0.06-0.13之间。同时，虽然对另外6株白色念珠菌敏感株，FICI＞0.5，LND与FLC联用无明显协同作用，但LND的最低抑菌浓度也能从≥512μg/mL降至32-64μg/mL。
(2)LND联合FLC能产生协同抗白色念珠菌生物膜的作用
实验结果表明，LND+FLC对抗预形成时间较短(≤8h)的白色念珠菌生物膜具有协同作用，其中FLC的生物膜最低抑菌浓度能由≥1024μg/mL被降低至2-8μg/mL，FICIs＜0.5。同时我们也观察到，虽然随着形成生物膜的时间延长，药物联用对白色念珠菌在12h和24h预形成的生物膜显示出无关作用，但当作用于预形成时间为12h的生物膜时，FLC的sMIC仍可被LND显著降低128-512倍，具有一定的意义。
(3)LND联合FLC在大蜡螟幼虫体内具有协同抗真菌作用
LND联合FLC使用在大蜡螟体内具有协同抗真菌作用，具体表现为与其它3组相比，LND-FLC药物联用时大大增加幼虫的存活数量，显著降低死亡率，且明显减少幼虫体内的白色念珠菌含量，同时，能显著减少组织中黑色菌块的大小、数量，仅有个别微小菌块散落于组织中，即能减弱对幼虫组织的损伤程度。
(4)LND联合FLC具有抑制耐药白色念珠菌菌丝的形态转变的作用
与对照组相比，FLC单用可略微减少菌丝的数量，但对菌丝长度无明显影响。LND单用可使白色念珠菌菌丝变短，数量无明显变化，且大多呈聚集状态。但LND联合FLC能使白色念珠菌在Spider培养基中的菌丝长度显著变短，数量也明显减少，且有圆形的酵母态细胞存在，即意味着LND+FLC能抑制CA10菌丝从酵母态到菌丝态的形态转换。
(5)LND联合FLC可以激活白色念珠菌胞内半胱氨酸蛋白酶，但不会引起活性氧蓄积
与对照组、药物单用组相比，LND-FLC联用组中的活性氧水平无明显升高或降低(P＞0.05)。此外，在显微镜下未观察到对照组与药物单用组中有荧光出现。然而，在LND+FLC组中，我们观察到，不仅真菌细胞数量明显减少，且发出了亮绿色荧光，表明了胞内半胱氨酸蛋白酶被激活，说明药物联用协同抗耐药白色念珠菌机制可能与激活真菌胞内半胱氨酸蛋白酶进而引起细胞凋亡有关。
(6)LND联合FLC抗耐药白色念珠菌的作用与抑制药物转运体的活性无关
药物外排基因的过表达是白色念珠菌耐药的最常见机制之一。本部分使用Rh6G替代FLC进行实验。结果表明，与control组相比，LND组中Rh6G的吸收和外排曲线几乎没有差异(P＞0.05)，这提示我们LND和FLC的协同抗真菌作用与抑制药物转运蛋白的活性无关。
结论
本研究发现了LND的一种新型药理作用，即LND联合FLC使用对白色念珠菌的浮游细胞及预形成时间较短(≤8h)的生物膜具有协同抗真菌活性。此外，我们通过机理研究实验进一步阐明了协同抗真菌作用可能与抑制生物膜的形成、菌丝形态转变及激活真菌胞内半胱氨酸蛋白酶有关，但与增加胞内活性氧水平及抑制药物转运体的活性无关，其他协同机制仍需进一步研究。本论文希望为克服真菌的耐药性和基于糖代谢通路寻找新型抗真菌药物提供理论基础。