尼龙膜杂交检测放线菌基因组DNA同源性方法的建立

来源 :华南热带农业大学 海南大学 | 被引量 : 10次 | 上传用户:myloft1d
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本研究对实验室前期从红树林海洋环境中分离筛选获得的1株经过分类鉴定到属的链霉菌061324进行了DNA-DNA杂交同源性分析,确立为新种。 根据菌株061324的16S rDNA序列在GenBank中的Blastn搜索结果,与其相近的一株模式菌株为Streptomyces cheonanens NBRCl00940;另外选择基因组DNA研究比较透彻的Streptomyces coelicolor作为杂交的参考对照。 模式菌株S.cheonanensis购买自NITE Biological Resource Center,编号为NBRC100940ISP;2培养基活化。菌株061324、S.cheonanensis NBRC100940和S. coelicolor用YE液体发酵收集菌体,溶菌酶SDS法提取基因组DNA;采用人工接头PCR的方法(LA-PCR:linker-adaptor PCR)制备杂交探针。基因组DNA用Sau3AI(或Mbo I)酶切产生粘末端,在T4连接酶的作用下分别用S和P接头连接酶切后的DNA。用S接头中较短的单链S1进行PCR,扩增S接头连接产物,获得了大量的DNA,固定在尼龙膜上,紫外铰链lmin固定;用P接头中较短的单链PI进行PCR DIG标记,扩增P接头连接产物,作杂交的探针DNA。采用深圳依诺金生物科技有限公司生产的"Hyb高效杂交液"在66.5℃杂交20h,严格洗涤后,在抗DIG的碱性磷酸酶溶液中孵育30min,用NBT/BCIP暗显色,达到所需的信号强度后,蒸馏水终止显色。风干尼龙膜后照相保存。DOTS分析软件分析图片中的信号点,计算出两株菌间的杂交度为49.7%,为属内非常接近的种。 根据刘丽华等人的分类鉴定数据与标准株数据的比较,两株菌非常相似,这更进一步显示出DNA-DNA杂交在细菌分类,尤其是放线菌分类学中的重要地位。
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