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目的：通过研究格雷夫斯氏病（Graves disease，GD）中黏膜相关恒定T细胞（Mucosal-associated invariant T cells，MAIT）和自然杀伤恒定T细胞（Invariant natural killer T cells，iNKT）的频率、表型及细胞因子，初步探讨其免疫作用，为判断病情和疗效提供新指标，并为免疫治疗GD寻找新靶点。
方法：1.收集30例GD初治患者为治疗前组，其中19例131I治疗后的GD患者为治疗后组，25例健康体检中心的健康人为健康人对照组，采集三组外周血样本；2.采用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测三组外周血中MAIT频率、表面标志CD69及胞内产生的细胞因子干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）和颗粒酶B（granzyme B，GrzB），同时检测iNKT频率、表面标志CD69及胞内细胞因子IFN-γ，并检测健康人对照组、GD患者治疗前组MAIT的凋亡；3.采用微量样本多指标蛋白定量技术（Cytometric Bead Array，CBA）测定血浆细胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β的浓度；4.采用多细胞因子检测技术（LEGENDplex）测定血浆细胞因子IL-12p70、IL-18的浓度；5.采用逆转录定量聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测IL-4mRNA、IL-17A mRNA、IFN-γmRNA、TGF-βmRNA、IL-12p70mRNA、IL-18mRNA；6.体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激健康人和未治疗GD患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），体外刺激PBMCs培养24h后，采用FCM检测健康人对照组、未治疗GD患者组MAIT表面标志CD69、胞内细胞因子IFN-γ和GrzB；7.体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激健康人和未治疗GD患者的外周血PBMCs，体外刺激PBMCs培养5天后，采用FCM检测健康人刺激组、健康人未刺激组、GD患者刺激组、GD患者未刺激组的MAIT的凋亡，并检测健康人对照刺激组和健康人对照未刺激组MAIT表面标志CD69。
结果：1.与健康人对照组比较，GD患者治疗前组MAIT频率降低（P＜0.01）、CD69表达上调（P＜0.0001）、胞内IFN-γ产生减少（P＜0.0001）、胞内GrzB增加（P＜0.05），治疗后组MAIT频率也降低（P＜0.05）、CD69表达上调（P＜0.001）、胞内IFN-γ产生减少（P＜0.001）、胞内GrzB增加（P＜0.01）；治疗后组与治疗前组相比，MAIT频率轻度升高，差异无统计学意义（P＞0.05），CD69表达轻度上调，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内IFN-γ和GrzB轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。相关性分析发现，治疗前组和治疗后组产生GrzB的MAIT频率与MAIT总体频率都呈负相关（P＜0.05），治疗前组产生GrzB的MAIT频率和年龄呈正相关（P＜0.05），治疗前组外周血表达CD69的MAIT频率与血浆TRAb呈显著正相关（P＜0.01）。
2.和健康人对照组相比，GD患者中重度组MAIT频率降低（P＜0.01）、CD69表达上调（P＜0.001）、胞内IFN-γ减少（P＜0.001）、胞内GrzB增加（P＜0.05）；轻度组MAIT频率轻度降低，差异无统计学意义（P＞0.05），CD69表达上调（P＜0.01），胞内IFN-γ减少（P＜0.01），胞内GrzB轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。与轻度组相比，中重度组MAIT频率降低（P＜0.05），CD69表达上调（P＜0.05），胞内IFN-γ轻度减少，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内GrzB轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。
3.和健康人对照组相比，GD患者治疗前组iNKT频率升高（P＜0.05）、CD69表达上调（P＜0.01）、胞内IFN-γ产生减少（P＜0.05）；治疗后组iNKT频率轻度升高，差异无统计学意义（P＞0.05），CD69表达轻度上调，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内IFN-γ轻度减少，差异无统计学意义（P＞0.05）。与治疗前组相比，治疗后组iNKT频率降低（P＜0.05），CD69表达轻度下调，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内IFN-γ轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。将健康人对照组的iNKT频率和健康人对照组的MAIT频率做相关性分析，结果显示呈显著正相关（P＜0.01），但在GD患者治疗前组和治疗后组外周血中，iNKT频率和MAIT频率均没有相关性（P＞0.05）。
4.与健康人对照组比较，GD患者中重度组iNKT频率升高（P＜0.05）、CD69表达上调（P＜0.01）、胞内IFN-γ减少（P＜0.001）；轻度组iNKT的频率轻度升高，CD69表达轻度上调，胞内IFN-γ轻度减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与轻度组相比，中重度组iNKT频率轻度升高，CD69表达轻度上调，胞内IFN-γ轻度减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
5.与健康人对照组相比，GD患者治疗前组血浆IFN-γ（P＜0.0001）、IL-4（P＜0.01）和IL-17A（P＜0.0001）均升高，TGF-β轻度降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后组血浆IFN-γ（P＜0.001）、IL-17A（P＜0.001）、TGF-β（P＜0.0001）均高与健康人对照组，IL-4轻度升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。与治疗前组比较，治疗后组IL-17A降低（P＜0.01）、IL-4降低（P＜0.05），TGF-β升高（P＜0.0001），IFN-γ轻度降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。三组基因水平IFN-γmRNA、IL-4mRNA、IL-17A mRNA和TGF-βmRNA的相对表达差异与细胞因子蛋白水平基本一致。
6.GD患者治疗前组血浆细胞因子IL-12p70升高（P＜0.05）、IL-18升高（P＜0.01），治疗后组IL-12p70（P＜0.05）和IL-18（P＜0.0001）也升高，三组基因水平IL-12p70mRNA、IL-18mRNA的相对表达差异与细胞因子蛋白水平基本一致。治疗前GD患者MAIT凋亡率高于健康人对照组（P＜0.001）。体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激未治疗GD患者与健康人的PBMCs培养24h，结果显示，与健康人对照组相比，未治疗GD患者组MAIT表面CD69的表达轻度上调（P＞0.05），胞内IFN-γ轻度减少（P＞0.05），GrzB轻度增加（P＞0.05），差异均无统计学意义。体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激PBMCs培养5天后，健康人刺激组和GD患者刺激组MAIT凋亡率都分别高于两组对应的未刺激组（P＜0.05）。健康人刺激组MAIT表面CD69的表达相比健康人未刺激组有所上调（P＜0.01）。
结论：1.MAIT参与抗GD，iNKT参与GD的发病。2.GD患者治疗前体内的Th1、Th2、Th17应答都显著增强，Treg应答受抑制；治疗后Th2应答减弱，偏向于Th1，Treg应答显著增强，Th17应答减弱，Th17/Treg趋向平衡。3.IL-12和IL-18可能促进了GD患者MAIT的活化及活化后凋亡，导致MAIT频率降低。4.GD患者病情越严重，MAIT频率越低，CD69表达越高；GD患者病情越严重，iNKT频率越高，CD69表达越高；MAIT或iNKT的频率及细胞表面CD69的表达可以作为判断GD病情严重程度的新指标，iNKT的频率和功能变化对于疗效判断也具有重要作用，且MAIT和iNKT可作为GD免疫治疗新靶点。
方法：1.收集30例GD初治患者为治疗前组，其中19例131I治疗后的GD患者为治疗后组，25例健康体检中心的健康人为健康人对照组，采集三组外周血样本；2.采用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）检测三组外周血中MAIT频率、表面标志CD69及胞内产生的细胞因子干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）和颗粒酶B（granzyme B，GrzB），同时检测iNKT频率、表面标志CD69及胞内细胞因子IFN-γ，并检测健康人对照组、GD患者治疗前组MAIT的凋亡；3.采用微量样本多指标蛋白定量技术（Cytometric Bead Array，CBA）测定血浆细胞因子IL-4、IL-17A、IFN-γ、TGF-β的浓度；4.采用多细胞因子检测技术（LEGENDplex）测定血浆细胞因子IL-12p70、IL-18的浓度；5.采用逆转录定量聚合酶链式反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测IL-4mRNA、IL-17A mRNA、IFN-γmRNA、TGF-βmRNA、IL-12p70mRNA、IL-18mRNA；6.体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激健康人和未治疗GD患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），体外刺激PBMCs培养24h后，采用FCM检测健康人对照组、未治疗GD患者组MAIT表面标志CD69、胞内细胞因子IFN-γ和GrzB；7.体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激健康人和未治疗GD患者的外周血PBMCs，体外刺激PBMCs培养5天后，采用FCM检测健康人刺激组、健康人未刺激组、GD患者刺激组、GD患者未刺激组的MAIT的凋亡，并检测健康人对照刺激组和健康人对照未刺激组MAIT表面标志CD69。
结果：1.与健康人对照组比较，GD患者治疗前组MAIT频率降低（P＜0.01）、CD69表达上调（P＜0.0001）、胞内IFN-γ产生减少（P＜0.0001）、胞内GrzB增加（P＜0.05），治疗后组MAIT频率也降低（P＜0.05）、CD69表达上调（P＜0.001）、胞内IFN-γ产生减少（P＜0.001）、胞内GrzB增加（P＜0.01）；治疗后组与治疗前组相比，MAIT频率轻度升高，差异无统计学意义（P＞0.05），CD69表达轻度上调，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内IFN-γ和GrzB轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。相关性分析发现，治疗前组和治疗后组产生GrzB的MAIT频率与MAIT总体频率都呈负相关（P＜0.05），治疗前组产生GrzB的MAIT频率和年龄呈正相关（P＜0.05），治疗前组外周血表达CD69的MAIT频率与血浆TRAb呈显著正相关（P＜0.01）。
2.和健康人对照组相比，GD患者中重度组MAIT频率降低（P＜0.01）、CD69表达上调（P＜0.001）、胞内IFN-γ减少（P＜0.001）、胞内GrzB增加（P＜0.05）；轻度组MAIT频率轻度降低，差异无统计学意义（P＞0.05），CD69表达上调（P＜0.01），胞内IFN-γ减少（P＜0.01），胞内GrzB轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。与轻度组相比，中重度组MAIT频率降低（P＜0.05），CD69表达上调（P＜0.05），胞内IFN-γ轻度减少，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内GrzB轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。
3.和健康人对照组相比，GD患者治疗前组iNKT频率升高（P＜0.05）、CD69表达上调（P＜0.01）、胞内IFN-γ产生减少（P＜0.05）；治疗后组iNKT频率轻度升高，差异无统计学意义（P＞0.05），CD69表达轻度上调，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内IFN-γ轻度减少，差异无统计学意义（P＞0.05）。与治疗前组相比，治疗后组iNKT频率降低（P＜0.05），CD69表达轻度下调，差异无统计学意义（P＞0.05），胞内IFN-γ轻度增加，差异无统计学意义（P＞0.05）。将健康人对照组的iNKT频率和健康人对照组的MAIT频率做相关性分析，结果显示呈显著正相关（P＜0.01），但在GD患者治疗前组和治疗后组外周血中，iNKT频率和MAIT频率均没有相关性（P＞0.05）。
4.与健康人对照组比较，GD患者中重度组iNKT频率升高（P＜0.05）、CD69表达上调（P＜0.01）、胞内IFN-γ减少（P＜0.001）；轻度组iNKT的频率轻度升高，CD69表达轻度上调，胞内IFN-γ轻度减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与轻度组相比，中重度组iNKT频率轻度升高，CD69表达轻度上调，胞内IFN-γ轻度减少，但差异无统计学意义（P＞0.05）。
5.与健康人对照组相比，GD患者治疗前组血浆IFN-γ（P＜0.0001）、IL-4（P＜0.01）和IL-17A（P＜0.0001）均升高，TGF-β轻度降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗后组血浆IFN-γ（P＜0.001）、IL-17A（P＜0.001）、TGF-β（P＜0.0001）均高与健康人对照组，IL-4轻度升高，差异无统计学意义（P＞0.05）。与治疗前组比较，治疗后组IL-17A降低（P＜0.01）、IL-4降低（P＜0.05），TGF-β升高（P＜0.0001），IFN-γ轻度降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。三组基因水平IFN-γmRNA、IL-4mRNA、IL-17A mRNA和TGF-βmRNA的相对表达差异与细胞因子蛋白水平基本一致。
6.GD患者治疗前组血浆细胞因子IL-12p70升高（P＜0.05）、IL-18升高（P＜0.01），治疗后组IL-12p70（P＜0.05）和IL-18（P＜0.0001）也升高，三组基因水平IL-12p70mRNA、IL-18mRNA的相对表达差异与细胞因子蛋白水平基本一致。治疗前GD患者MAIT凋亡率高于健康人对照组（P＜0.001）。体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激未治疗GD患者与健康人的PBMCs培养24h，结果显示，与健康人对照组相比，未治疗GD患者组MAIT表面CD69的表达轻度上调（P＞0.05），胞内IFN-γ轻度减少（P＞0.05），GrzB轻度增加（P＞0.05），差异均无统计学意义。体外加入IL-12p70和IL-18重组蛋白刺激PBMCs培养5天后，健康人刺激组和GD患者刺激组MAIT凋亡率都分别高于两组对应的未刺激组（P＜0.05）。健康人刺激组MAIT表面CD69的表达相比健康人未刺激组有所上调（P＜0.01）。
结论：1.MAIT参与抗GD，iNKT参与GD的发病。2.GD患者治疗前体内的Th1、Th2、Th17应答都显著增强，Treg应答受抑制；治疗后Th2应答减弱，偏向于Th1，Treg应答显著增强，Th17应答减弱，Th17/Treg趋向平衡。3.IL-12和IL-18可能促进了GD患者MAIT的活化及活化后凋亡，导致MAIT频率降低。4.GD患者病情越严重，MAIT频率越低，CD69表达越高；GD患者病情越严重，iNKT频率越高，CD69表达越高；MAIT或iNKT的频率及细胞表面CD69的表达可以作为判断GD病情严重程度的新指标，iNKT的频率和功能变化对于疗效判断也具有重要作用，且MAIT和iNKT可作为GD免疫治疗新靶点。