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丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科鼠尾草属多年生草本药用植物,以根及根茎入药,具有祛瘀止痛,活血通经,凉血消痈,清心除烦之功效,被广泛应用于冠心病和脑血管病等疾病的治疗。迄今,已从丹参中分离鉴定了 70余种有效成分,这些成分包含两大类,一类是脂溶性的丹参酮类,如丹参酮ⅡA、丹参酮Ⅰ等;另一类是水溶性酚酸类,如丹参素、丹酚酸B等。因具有繁殖及遗传操作简单,次生代谢物丰富等特点,丹参已成为药用植物研究的模式生物之一。近年来,由于丹参野生资源紧缺,栽培品种品质退化等原因,提高丹参中活性成分的含量、培育优质新品种已成为丹参资源开发中亟待解决的关键问题之一。其活性成分合成的关键酶基因的研究已逐渐成为丹参研究的热点。但目前克隆得到的关键酶基因还仅限于活性成分合成的中上游途径上,且成员单一,对基因家族整体认识不清。并且活性成分下游合成途径,相关关键酶基因和整个合成途径上的关键调节基因(如转录因子等)还不清楚。这些问题都制约着丹参活性成分积累的分子机理研究,阻碍着丹参分子育种的进程。基于此,本研究从以下几个方面开展工作:1.丹参转录组de novo测序分析采用Solexa高通量测序技术,以不同发育阶段丹参为材料,进行转录组de novo办测序分析。共得到1.2Gb测序序列,组装后得到56,774条unigene(GenBank注册号码:SRA020132),并发现丹参萜类合成骨干途径及二萜类合成相关的unigene 200条(编码60余条新的转录本);有523条unigene(编码47个酶)涉及苯丙烷合成途径,156条unigene(编码17个酶)涉及酪氨酸途径;其中有47条unigene(编码24个酶)与迷迭香酸合成途径相关。此外,识别到1,341条unigene编码丹参转录因子。该工作极大丰富了丹参的基因背景,为丹参功能基因研究奠定了一定的基础。2.丹参数字表达谱分析采用数字表达谱对MeJA和真菌诱导子处理下的丹参表达谱进行了研究,分别筛选出差异基因2,131条和1,652条,其中丹参主要有效成分的两条合成途径上差异基因各有13条和4条;分别筛选出差异表达转录因子54条和44条,其中包括MYB、AP2-EREBP、bHLH和WRKY类转录因子等与次生代谢调控相关的转录因子家族的多条基因。3.部分丹参酮合成相关基因的克隆分析在高通量转录组测序数据分析的基础上,采用BD-walking和RT-PCR等方法克隆得到丹参酮合成相关的新基因SmFPPS1、SmIPI1和SmGCPS3,并对其序列特征、表达模式进行了研究:(1)SmFPPS1全长1,320bp,包含一个1,050bP的ORF,编码蛋白含有349氨基酸残基。生物信息学分析显示SmFPPS1定位于细胞质,二级结构主要有α-螺旋组成。遗传互补实验显示SmFPPS1不具有GGPP合酶的活性。SmFPPS1主要在丹参花中表达,可被MeJA和病原菌所诱导。(2)SmIPI1基因全长1243bp,编码226个氨基酸残基。结构分析表明SmIPI1为亲水性α/β蛋白,包含有IPP异构酶结构域。SmIPI1在丹参生长的各个时期呈组成型表达,受MeJA和根腐病菌的诱导。(3)SmGGPPS3全长2,908 bp(cDNA序列长],051 bp),含一个内含子和完整的ORF(960 bp,编码319个氨基酸)。SmGGPPS3与蓖麻等植物GGPPS的一致性达到67%以上,含转异戊烯基转移酶特征结构域,亚细胞定位预测显示定位于线粒体。系统进化分析显示,SmGGPPS3与拟南芥AtGGPS3最为相近。遗传互补实验证实,SmGGPPS3具有GGPP合酶活性。SmGGPPS3在丹参根、茎、叶中呈一定的组成型表达,受到病原菌和MeJA等逆境信号的诱导。4.丹参过表达SmGGPPS1研究GGPPS是植物二萜合成途径的关键酶基因之一。通过农杆菌介导的丹参转基因技术体系,在丹参中过表达SmGGPPS1,得到了 34个阳性转基因株系:阳性植株的丹参酮IIA达到对照的2倍以上;采用real-time PCR方法对丹参酮合成关键酶基因表达进行检测,发现转基因株系中 SmHMGR1、SmDXS1、SmDXS2、SmCPSM、SmGGPPS2 和 SmGGPPS3 等关键酶基因的表达上调。而且叶绿素和类胡萝卜素等以GGPP为前体的化合物的含量也出现了上升的趋势。从分子水平阐述了 SmGGPPS1对丹参酮合成的重要调控作用的机制。5.丹参过表达AtMYB40研究分析拟南芥芯片中萜类合酶表达信息发现,AtMYB40与二萜合成关键酶基因CGPPS具有一定的共表达相关性。在丹参中过表达AtMYB40后发现,过表达株系中总丹参酮的含量提高为对照的1.35～1.51倍,丹参酮IIA含量达到对照的1.57～1.85倍,水溶性丹酚类成分与对照株系相比无明显变化。对丹参酮合成关键酶基因表达进行检测;AtMYB40激活SmHMGR1、SmDXS2和SmCPS1等基因的表达,但同时抑制了 SmGGPS1的表达。本研究初步揭示了其调控丹参酮ⅡA合成的机制。在AtMYB40低表达株系]M3中,AtMYB40激活了类胡萝卜素合成途径中SmPYS3的表达,促进了转基因株系中类胡萝卜素的合成。