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第一部分miR-124在颞叶癫痫患者及动物模型中表达研究目的：研究miR-124在难治性颞叶癫痫患者颞叶脑组织中表达及miR-124在氯化锂-匹鲁卡品诱导的颞叶癫痫大鼠模型海马脑组织中表达的变化规律。方法：1.从本课题组建立的癫痫脑库中随机抽取10例难治性癫痫患者颞叶脑组织标本和6例年龄性别匹配的对照组颞叶脑组织标本。2.成年雄性SD大鼠，随机分为正常对照组（n=8）与癫痫组（亚组：6h组、1d组、2d组、3d组、7d组,各组n=8），经腹腔给予氯化锂-匹鲁卡品注射，构建颞叶癫痫动物模型。3.荧光定量PCR检测miR-124在人颞叶脑组织中的表达和大鼠海马组织中的表达变化。结果：1. miR-124在颞叶癫痫患者中表达：与对照组相比，miR-124在难治性癫痫患者脑组织中表达水平显著降低（P＜0.05）；2. miR-124在颞叶癫痫大鼠模型中表达：与对照组相比，在氯化锂-匹鲁卡品癫痫大鼠模型海马脑组织中，癫痫动物模型各时间点组（亚组：6h组、1d组、2d组、3d组、7d组），miR-124表达均降低（P＜0.05）。结论：在颞叶癫痫患者和动物模型脑组织中miR-124表达均降低，这些改变可能参与了癫痫的发生和形成过程。第二部分miR-124agomir对大鼠痫性发作影响目的：通过miR-124激动剂（agomir）及其阴性对照（agomir control）对大鼠进行双侧海马立体定位注射干预，了解miR-124在体内水平改变对大鼠痫性发作的影响。方法：1.成年雄性SD大鼠，随机分为正常对照（NC）组、 agomir control(AC)干预组和agomir (AG)干预组； agomir干预组在给予匹鲁卡品腹腔注射建模前随机分组，分别给予：A组. microRNAagomir o.2nmol、B组. microRNA agomir o.6nmol、C组. microRNA agomir1.0nmol；2.应用荧光定量PCR和免疫荧光技术检测agomir干预效率，确定干预有效后进行建模；3.采用匹鲁卡品腹腔注射建模，观察注射后大鼠行为学改变。结果：1. agomir体内干预效果检测：激光共聚焦显微镜观察发现，在miR-124agomir立体定位注射后，大鼠海马神经元内可见CY3标记的miR-124agomir红色荧光；荧光定量PCR结果显示，使用1.0nmolagomir海马注射后大鼠海马中miR-124相对水平较NC组和AC组表达升高40~50%，差异有统计学意义（P＜0.05）；2.大鼠行为学观察：大鼠腹腔注射匹鲁卡品后即开始观察其行为学，各组发作达到四级及以上只数比显示：对照组（7/8）AC组（8/8）、0.2nmol AG组（7/8）、0.6nmol AG组（5/8）、1.0nmol AG组(4/8)。发作潜伏期结果显示: NC组(20.43±7.61s)，AC组(21.63±6.02s)和0.2nmol AG组(26.57±11.12s),三组间平均发作潜伏期比较无明显改变，差异无统计学意义（P＞0.05）；0.6nmolAG组(32.2±4.97s)平均发作潜伏期较AC组降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；1.0nmolAG组(52.25±12.66s)平均发作潜伏期较AC组延长，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。可见miR-124agomir1.0nmol干预对癫痫发作有部分修饰作用。结论：1.有效剂量agomir干预可明显升高大鼠海马中miR-124相对表达水平；2.有效剂量agomir干预后可明显延长匹鲁卡品诱发后大鼠痫性发作潜伏期。第三部分miR-124在大鼠痫性发作中作用机制研究目的：通过miR-124激动剂（agomir）及其阴性对照（agomir control）对大鼠进行双侧海马立体定位注射干预，了解miR-124在体内水平改变对大鼠海马神经元痫样放电的影响。通过全细胞膜片钳技术和分子生物学技术，研究大鼠模型离体脑片电生理学指标和脑内分子生物学指标的改变，探讨miR-124对大鼠神经元兴奋性的影响及对其靶基因CREB的影响。方法：用匹鲁卡品对miR-124agomir及agomir control干预后的大鼠进行腹腔注射建模，应用膜片钳技术检测各组大鼠海马脑片的放电情况:动作电位（AP）,微小兴奋性突触后电流（mEPSC），诱发兴奋性突触后电流（eEPSC，包括：NMDAR介导的EPSC、AMPAR介导的EPSC）。应用荧光定量PCR技术检测miR-124、CREB mRNA在动物海马中的表达；应用免疫组织化学、Western blot技术检测pCREB,NMDAR1, GLUR1在动物海马总蛋白中表达差异及NMDAR1, GLUR1在动物海马膜蛋白中表达差异。结果：1.电生理实验脑片制备：按本课题方法制备的成年大鼠脑片适用于全细胞膜片钳实验。2.自发动作电位：给予有效剂量的agomir干预并建模后，可观察到各组间自发性动作电位频率有显著性差异（P＜0.05）；pilo+agomircontrol组（pilo+AC组）的自发性动作电位频率显著高于normal control组（NC组）（P＜0.05）；和NC组相比，pilo+agomir组（pilo+AG组）癫痫大鼠海马脑片神经细胞自发性动作电位频率仍有增高（P＜0.05），但pilo+AG组较pilo+AC组有明显降低（P＜0.05）。3. mEPSC：1）频率：给予有效剂量的agomir干预并建模后，可观察到，pilo+AC组大鼠海马脑片神经细胞mEPSC的发放频率与NC组相比明显增加（P＜0.05）；pilo+AG组大鼠海马脑片神经细胞mEPSC的发放频率与对照组相比亦增加（P＜0.05），但pilo+AG组较pilo+AC组有明显降低（P＜0.05）;2）振幅累积分布曲线：给予有效剂量的agomir干预并建模后，可观察到， pilo+AG组大鼠海马脑片神经细胞mEPSC振幅累积分布曲线与NC组相比，曲线未见明显偏移， KS统计差异无显著性（P＞0.05）; pilo+AC组大鼠海马脑片神经细胞mEPSC振幅累积分布曲线与NC组相比，曲线向右偏移，KS统计差异有显著性（P＜0.05）； pilo+AG组大鼠海马脑片神经细胞mEPSC振幅累积分布曲线与pilo+AC组相比，曲线向左偏移， KS统计差异有显著性（P＜0.05）。4.Evoke EPSC：统计各组NMDAR和AMPAR介导的兴奋性突触后电流幅值发现，给予有效剂量的agomir干预并建模后，可观察到，pilo+AC组大鼠海马脑片神经细胞NMDAR EPSC的幅值较NC组明显增加（P＜0.05）； pilo+AG组大鼠海马脑片神经细胞NMDAR EPSC的幅值与NC组相比亦增加（P＜0.05），但pilo+AG组较pilo+AC组NMDAR EPSC幅值明显降低(P＜0.05）。pilo+AC组大鼠海马脑片神经细胞AMPAR EPSC的幅值较NC组明显增加(P＜0.05）；pilo+AG组大鼠海马脑片神经细胞AMPAR EPSC的幅值与NC组相比亦增加(P＜0.05），但pilo+AG组较pilo+AC组AMPAR EPSC幅值明显降低(P＜0.05）。5. CREB、NMDAR、GLUR1表达:给予有效剂量的agomir干预并建模后，可观察到agomir干预后可明显降低大鼠海马神经元CREBmRNA表达和海马神经元总蛋白中pCREB蛋白表达（P＜0.05）。给予有效剂量的agomir干预并建模后，可观察到agomir干预后可明显降低大鼠海马神经元细胞膜蛋白中NMDAR1蛋白表达（P＜0.05）结论：1.有效剂量的agomir干预可降低匹鲁卡品诱导大鼠海马脑片神经细胞自发动作电位频率；2.有效剂量的agomir干预可降低匹鲁卡品诱导大鼠海马脑片神经细胞mEPSC频率及幅值；3.有效剂量的agomir干预可降低匹鲁卡品诱导大鼠海马脑片神经细胞NMDAR和AMPAR介导的EPSC的幅值；4.有效剂量的agomir干预可降低匹鲁卡品诱导大鼠海马中CREB表达和神经元细胞膜上NMDAR1表达。