论文部分内容阅读
番茄Solanum lycopersicum L.作为全球种植规模最广的蔬菜作物之一,被消费者广泛喜爱,但在生产上却很容易遭受到病害的侵染。其中,灰霉病是一种坏死营养型的病害,被列为世界上第二大真菌性病原体病害,它能够大范围的侵染露地和设施栽培的番茄,对番茄产业造成严重的经济损失。因此,挖掘番茄响应灰霉菌的基因,解析番茄对灰霉菌抗性的分子机制,有利于通过分子手段加速抗病育种的进程。番茄TPK1b基因编码一个定位在质膜上的RLCK蛋白激酶,其被报道能够正向调节番茄对灰霉病的抗性。本研究通过对TPK1b启动子的酵母单杂交钓库实验筛选到一部分转录因子,然后对这些转录因子进行番茄中的遗传转化,并对转基因植株进行灰霉菌接种试验,鉴定到一个能够负调控番茄对灰霉菌抗性的WRKY蛋白Sl WRKY3。我们对Sl WRKY3的抗性调控机制进行了初步的解析,研究结果表明,Sl WRKY3能够负调控TPK1b基因的表达,进而影响SA、ROS等信号最终实现对番茄抗灰霉病抗性的调控。本论文主要研究结果如下:1.通过网站预测发现在TPK1b基因上游3000bp启动子部分存在很多顺式作用元件,包括光、激素和其他生命活动过程的响应元件,对该部分的TPK1b启动子进行酵母单杂交钓库实验,鉴定到了若干能与其结合的转录因子。我们挑选了一些转录因子在番茄中进行了超量和干涉的遗传转化,然后对转基因植株进行灰霉菌接种实验,发现只有Sl WRKY3的转基因植株对灰霉菌的抗性发生了改变,Sl WRKY3超量株系对灰霉菌表现出易感性,相反,干涉株系则对灰霉菌有着更高的抗性。2.对Sl WRKY3的氨基酸序列进行比对分析,发现它是一个进化保守的WRKY家族蛋白,包含两个WRKYGQK保守结构域和两个C2H2类型的锌指基序,是一个典型的Ⅰ型WRKY蛋白,并且通过序列比对和进化树分析,Sl WRKY3与其他的Ⅰ型WRKY蛋白有着很高的序列相似性和同源性。网站预测其定位在细胞核,且包含一段核定位信号。组织表达分析发现,Sl WRKY3在花中表达量最高,其次是叶片和红熟果实,在根和茎中的表达量最低。3.TPK1b启动子上存在若干个W-box元件,通过进一步的酵母单杂交实验发现Sl WRKY3能够与其中两个W-box相结合。为了探究Sl WRKY3对TPK1b表达的调控,我们检测了Sl WRKY3转基因株系中的Sl WRKY3和TPK1b表达量关系:发现Sl WRKY3超量株系中TPK1b表达量相较对照A57而言显著偏低,而Sl WRKY3干涉株系中TPK1b表达量则统一偏高,说明在番茄植株中Sl WRKY3能够负向调控TPK1b的表达。从Sl WRKY3转基因株系接种灰霉菌后Sl WRKY3和TPK1b的表达变化模式也能看出它们之间的负相关性。4.A57植株接种灰霉菌后,Sl WRKY3的表达能够在短时间内被迅速激活。我们对Sl WRKY3转基因植株进行灰霉菌的接种,并在接种后不同时间点对信号通路标记基因的表达情况进行检测,在所检测的基因中,发现SA途径的标记基因PR1,ROS途径的相关基因CAT1、CAT2的表达量在Sl WRKY3超量和干涉株系中有着相反的表达趋势。为了进一步探究Sl WRKY3与这些信号通路的关系,我们使用DAB染色检测了Sl WRKY3转基因植株接种灰霉菌后ROS的产生,发现Sl WRKY3超量株系ROS的产生要显著高于干涉株系。总的来说,Sl WRKY3能够调控TPK1b影响SA和ROS的信号通路进而负调控番茄对灰霉病的抗性。