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第一部分ALA-PDT对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型角蛋白表达异常及角化不全影响的研究
背景:银屑病是皮肤科临床遇最常见慢性疾病之一。临床上特征的表现为为红色丘疹或斑块，上覆银白色鳞屑，刮破鳞屑可见薄膜现象及点状出血现象(Auspitz征)。同时现阶段该疾病无法根治，易复发，并可造成全身系统损害。近年来越来越多的研究证实，5-氨基酮戊酸光动力疗法能有效治疗银屑病。本实验采用小鼠作为研究对象，用外涂咪喹莫特乳膏诱导的银屑病样模型，研究ALA-PDT疗后对其是否有作用，并尝试探寻其发病机理。
目的:本研究旨在观察ALA-PDT对咪喹莫特乳膏诱导小鼠银屑病样模型角蛋白表达异常及角化不全影响。
方法:7-9周龄小鼠，每日背部外涂咪喹莫特乳膏。将实验动物随机分5组:1、空白对照组;2、咪喹莫特组;3、咪喹莫特+单独红光组;4、咪喹莫特+单独ALA组;5、咪喹莫特后使用ALA-PDT组。每组5只小鼠。在8天内观察小鼠皮肤皮损大体情况(红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数)、HE染色(观察各组小鼠表皮过度角化及角化不全的情况)、免疫印记(检测小鼠皮肤K17及JAK通路的表达情况)。
结果:
1.ALA-PDT对咪喹莫特所致银屑病样皮损有抑制作用
与对照组相比，咪喹莫特组红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数增加，差别有统计学意义，而单纯ALA和单纯红光照射无明显改变。ALA-PDT则可改善咪喹莫特所致银屑病样皮损，使红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数下降。
2.ALA-PDT对咪喹莫特所致银屑病样皮损角蛋白表达异常及角化不良有抑制作用
HE染色显示，与对照组相比，咪喹莫特组表皮角化过度及角化不良，而单纯ALA和单纯红光对表皮无明显改变。ALA-PDT则可改善咪喹莫特所致表皮角化过度及角化不良。
3.ALA-PDT对咪喹莫特所致小鼠银屑病样皮损JAK通路有抑制作用
Westernblot结果显示，与对照组相比，咪喹莫特组中K17、JAK1和JAK2表达量明显上升，差别有统计学意义。而单纯外用ALA和单独红光对K17、JAK1和JAK2表达量无明显改变。外用ALA-PDT则可改善咪喹莫特所致K17、JAK1和JAK2表达量上升。同时，与空白对照组相比，咪喹莫特组中SOCs1、SOCs3表达明显上升，差别有统计学意义。而ALA-PDT干预后其表达水平出现上调，差别有统计学意义。
结论:体内实验中，5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)抑制咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型角质形成细胞角蛋白表达异常及过度增殖。5-氨基酮戊酸光动力疗法可减轻银屑病样皮损其红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数，角质形成细胞过度角化及角化不全。同时，通过JAK通路抑制K17、JAK1和JAK2表达。
关键词:5-氨基酮戊酸;光动力疗法;小鼠;咪喹莫特;银屑病
第二部分ALA-PDT对IFN-γ诱导的角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖的机制研究
背景:早期的研究表明，自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞产生的干扰素(IFN)-γ对角质形成细胞具有促进炎症反应，在银屑病的发病过程中起巨大作用。而且，血清中的IFN-γ表达与银屑病的临床严重程度和活性相关因此，IFN-γ可能是角质形成细胞过度增殖的诱导剂，而角蛋白(Keratin17，K17)可以用作评估银屑病治疗效果的标志物。银屑病皮损越严重，K17表达水平越高，表明K17在银屑病发病机理中起作用。因此，IFN-γ可能是角质形成细胞过度增殖的诱导剂，而K17可以用作评估银屑病治疗效果的标志物。
最近，JAK蛋白已成为治疗包括银屑病在内的自身免疫性炎性疾病的新治疗靶标。通过免疫细胞将细胞因子信号转化为调节增殖和分化的基因反应，JAK信号转导子和转录激活子(STAT)通路在介导炎症性免疫反应中起着关键作用。已有学者证明证明，在银屑病皮损中STAT3的表达上调。而在转基因小鼠模型中，表皮基底干细胞层中过表达活化的STAT3的能够重够银屑病的很多临床特征。
目的:本研究旨在ALA-PDT通过JAK通路对IFN-γ诱导的角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖的机制的影响。
方法:角质形成细胞在37℃，5％CO2培养箱下用的DMEM培养基进行培养。IFN-γ构建过度角化角蛋白表达异常及增殖模型，并且随机将实验分4组:1、空白对照组;2、IFN-γ组;3、ALA-PDT组;4、IFN-γ+ALA-PDT组。先检测不同浓度的ALA对角质形成细胞活性的影响，不同剂量的红光对角质形成细胞活性的影响，确定合适的银屑病样模型。后检测细胞增殖活性(CCK-8法)、细胞周期、过度角化及过度增殖相关蛋白K17及JAK通路的表达情况(WesternBlot法)。
结果:
1、不同浓度的ALA对角质形成细胞活性无显著影响
不同浓度ALA对角质形成细胞增殖活性的影响发现，随着5-氨基酮戊酸浓度的增加，没有影响到角质形成细胞其活性，与与对照组相比，无明显差异。
2、不同剂量的红光对角质形成细胞活性的影响
发现红光在2J/cm2时下降5％，照光剂量4J/cm2以上细胞凋亡逐渐明显，增殖活性下降50％。提示ALA-PDT随着照光剂量的增加有促进角质形成细胞凋亡的作用。
3、ALA-PDT对IFN-γ诱导角质形成细胞增殖的影响
CCK8结果显示，IFN-γ组角质形成细胞与空白对照组相比，增殖活性明显上升。而ALA-PDT则可逆转其细胞增殖活性。
4、ALA-PDT对IFN-γ诱导角质形成细胞细胞周期的影响
以流式细胞仪方法检测ALA-PDT干预后角质形成细胞中细胞周期的变化:发现IFN-γ诱导的角质形成细胞G1期显著下降(P＜0.05)。而在ALA-PDT干预后与IFN-γ组相比，G1期上升明显(P＜0.05)。
5、ALA-PDT对IFN-γ诱导角质形成细胞JAK通路的影响
Westernblot结果显示，IFN-γ组中K17、JAK1和JAK2表达量与对照组相比明显上升，差别有统计学意义。而单纯外用ALA-PDT对K17、JAK1和JAK2表达量无明显改变。外用ALA-PDT则可逆转IFN-γ所致K17、JAK1和JAK2表达量上升。同时，与空白对照组相比，IFN-γ组中Socs1、Socs3表达明显上升，差别有统计学意义。而ALA-PDT干预后其表达水平出现上调，差别有统计学意义。
结论:体外动物实验中，5-氨基酮戊酸光动力疗法抑制IFN-γ诱导角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖，使G1期显著上升，可能与调控JAK通路和角化及增殖相关的K17有关。
关键词:5-氨基酮戊酸;光动力疗法;角质形成细胞;IFN-γ;JAK通路
第三部分ALA-PDT通过产生活性氧ROS对IFN-γ诱导的角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖机制的研究
背景:光敏剂、光源、活性氧(reactive oxygen species，ROS)是光动力的三要素。光动力是光敏剂结合特定波长光，光敏剂吸收光后与氧发生一系列反应，通过细胞毒作用或影响细胞生物行为而发挥治疗作用。有研究指出，ALA-PDT用过产生ROS可加速角质形成细胞的凋亡，同时认为NAC(ROS消除剂)作为ROS抑制剂，能有效的用于ROS的研究。
目的:本研究旨在NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞其细胞活性的影响
方法:角质形成细胞在37℃，5％CO2条件下用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。IFN-γ构建过度角化角化不全及增殖模型，将实验随机分为4组:1、IFN-γ组;2、IFN-γ+ALA-PDT组;3、IFN-γ+NAC组;4、IFN-γ+ALA-PDT+NAC。检测细胞增殖活性(CCK-8法)、细胞周期、过度角化及过度增殖相关蛋白K17及JAK通路的表达情况(WesternBlot法)。
结果:
1、NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞其细胞活性的影响
CCK8结果显示，发现IFN-γ+ALA-PDT组细胞增殖水平显著下降，差异有统计学意义。而在NAC干预后与IFN-γ+ALA-PDT组相比，增殖表达水平上升明显，差异有统计学意义。
2、NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞细胞周期表达的影响
以流式细胞仪方法检测发现IFN-γ+ALA-PDT组诱导的角质形成细胞G1期显著上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。而在NAC干预后与IFN-γ+ALA-PDT组相比，角质形成细胞G1期显著上下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3、NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞JAK通路的的影响
Westernblot结果显示，与IFN-γ组相比，IFN-γ+ALA-PDT组中K17、JAK1和JAK2表达明显下降，差别有统计学意义。而NAC干预后其表达水平出现上调，差别有统计学意义。同时，与IFN-γ组相比，IFN-γ+ALA-PDT组中Socs1、Socs3表达明显上升，差别有统计学意义。而NAC干预后其表达水平出现下降，差别有统计学意义。
结论:体外实验中，5-氨基酮戊酸光动力疗法通过产生活性氧抑制IFN-γ诱导角质形成细胞过度角化及增殖，使G1期显著上升，可能与调控JAK通路和角化及增殖相关的K17有关。
背景:银屑病是皮肤科临床遇最常见慢性疾病之一。临床上特征的表现为为红色丘疹或斑块，上覆银白色鳞屑，刮破鳞屑可见薄膜现象及点状出血现象(Auspitz征)。同时现阶段该疾病无法根治，易复发，并可造成全身系统损害。近年来越来越多的研究证实，5-氨基酮戊酸光动力疗法能有效治疗银屑病。本实验采用小鼠作为研究对象，用外涂咪喹莫特乳膏诱导的银屑病样模型，研究ALA-PDT疗后对其是否有作用，并尝试探寻其发病机理。
目的:本研究旨在观察ALA-PDT对咪喹莫特乳膏诱导小鼠银屑病样模型角蛋白表达异常及角化不全影响。
方法:7-9周龄小鼠，每日背部外涂咪喹莫特乳膏。将实验动物随机分5组:1、空白对照组;2、咪喹莫特组;3、咪喹莫特+单独红光组;4、咪喹莫特+单独ALA组;5、咪喹莫特后使用ALA-PDT组。每组5只小鼠。在8天内观察小鼠皮肤皮损大体情况(红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数)、HE染色(观察各组小鼠表皮过度角化及角化不全的情况)、免疫印记(检测小鼠皮肤K17及JAK通路的表达情况)。
结果:
1.ALA-PDT对咪喹莫特所致银屑病样皮损有抑制作用
与对照组相比，咪喹莫特组红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数增加，差别有统计学意义，而单纯ALA和单纯红光照射无明显改变。ALA-PDT则可改善咪喹莫特所致银屑病样皮损，使红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数下降。
2.ALA-PDT对咪喹莫特所致银屑病样皮损角蛋白表达异常及角化不良有抑制作用
HE染色显示，与对照组相比，咪喹莫特组表皮角化过度及角化不良，而单纯ALA和单纯红光对表皮无明显改变。ALA-PDT则可改善咪喹莫特所致表皮角化过度及角化不良。
3.ALA-PDT对咪喹莫特所致小鼠银屑病样皮损JAK通路有抑制作用
Westernblot结果显示，与对照组相比，咪喹莫特组中K17、JAK1和JAK2表达量明显上升，差别有统计学意义。而单纯外用ALA和单独红光对K17、JAK1和JAK2表达量无明显改变。外用ALA-PDT则可改善咪喹莫特所致K17、JAK1和JAK2表达量上升。同时，与空白对照组相比，咪喹莫特组中SOCs1、SOCs3表达明显上升，差别有统计学意义。而ALA-PDT干预后其表达水平出现上调，差别有统计学意义。
结论:体内实验中，5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)抑制咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型角质形成细胞角蛋白表达异常及过度增殖。5-氨基酮戊酸光动力疗法可减轻银屑病样皮损其红斑、鳞屑、厚度及综合评分指数，角质形成细胞过度角化及角化不全。同时，通过JAK通路抑制K17、JAK1和JAK2表达。
关键词:5-氨基酮戊酸;光动力疗法;小鼠;咪喹莫特;银屑病
第二部分ALA-PDT对IFN-γ诱导的角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖的机制研究
背景:早期的研究表明，自然杀伤(NK)细胞和CD4+T细胞产生的干扰素(IFN)-γ对角质形成细胞具有促进炎症反应，在银屑病的发病过程中起巨大作用。而且，血清中的IFN-γ表达与银屑病的临床严重程度和活性相关因此，IFN-γ可能是角质形成细胞过度增殖的诱导剂，而角蛋白(Keratin17，K17)可以用作评估银屑病治疗效果的标志物。银屑病皮损越严重，K17表达水平越高，表明K17在银屑病发病机理中起作用。因此，IFN-γ可能是角质形成细胞过度增殖的诱导剂，而K17可以用作评估银屑病治疗效果的标志物。
最近，JAK蛋白已成为治疗包括银屑病在内的自身免疫性炎性疾病的新治疗靶标。通过免疫细胞将细胞因子信号转化为调节增殖和分化的基因反应，JAK信号转导子和转录激活子(STAT)通路在介导炎症性免疫反应中起着关键作用。已有学者证明证明，在银屑病皮损中STAT3的表达上调。而在转基因小鼠模型中，表皮基底干细胞层中过表达活化的STAT3的能够重够银屑病的很多临床特征。
目的:本研究旨在ALA-PDT通过JAK通路对IFN-γ诱导的角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖的机制的影响。
方法:角质形成细胞在37℃，5％CO2培养箱下用的DMEM培养基进行培养。IFN-γ构建过度角化角蛋白表达异常及增殖模型，并且随机将实验分4组:1、空白对照组;2、IFN-γ组;3、ALA-PDT组;4、IFN-γ+ALA-PDT组。先检测不同浓度的ALA对角质形成细胞活性的影响，不同剂量的红光对角质形成细胞活性的影响，确定合适的银屑病样模型。后检测细胞增殖活性(CCK-8法)、细胞周期、过度角化及过度增殖相关蛋白K17及JAK通路的表达情况(WesternBlot法)。
结果:
1、不同浓度的ALA对角质形成细胞活性无显著影响
不同浓度ALA对角质形成细胞增殖活性的影响发现，随着5-氨基酮戊酸浓度的增加，没有影响到角质形成细胞其活性，与与对照组相比，无明显差异。
2、不同剂量的红光对角质形成细胞活性的影响
发现红光在2J/cm2时下降5％，照光剂量4J/cm2以上细胞凋亡逐渐明显，增殖活性下降50％。提示ALA-PDT随着照光剂量的增加有促进角质形成细胞凋亡的作用。
3、ALA-PDT对IFN-γ诱导角质形成细胞增殖的影响
CCK8结果显示，IFN-γ组角质形成细胞与空白对照组相比，增殖活性明显上升。而ALA-PDT则可逆转其细胞增殖活性。
4、ALA-PDT对IFN-γ诱导角质形成细胞细胞周期的影响
以流式细胞仪方法检测ALA-PDT干预后角质形成细胞中细胞周期的变化:发现IFN-γ诱导的角质形成细胞G1期显著下降(P＜0.05)。而在ALA-PDT干预后与IFN-γ组相比，G1期上升明显(P＜0.05)。
5、ALA-PDT对IFN-γ诱导角质形成细胞JAK通路的影响
Westernblot结果显示，IFN-γ组中K17、JAK1和JAK2表达量与对照组相比明显上升，差别有统计学意义。而单纯外用ALA-PDT对K17、JAK1和JAK2表达量无明显改变。外用ALA-PDT则可逆转IFN-γ所致K17、JAK1和JAK2表达量上升。同时，与空白对照组相比，IFN-γ组中Socs1、Socs3表达明显上升，差别有统计学意义。而ALA-PDT干预后其表达水平出现上调，差别有统计学意义。
结论:体外动物实验中，5-氨基酮戊酸光动力疗法抑制IFN-γ诱导角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖，使G1期显著上升，可能与调控JAK通路和角化及增殖相关的K17有关。
关键词:5-氨基酮戊酸;光动力疗法;角质形成细胞;IFN-γ;JAK通路
第三部分ALA-PDT通过产生活性氧ROS对IFN-γ诱导的角质形成细胞角蛋白表达异常及增殖机制的研究
背景:光敏剂、光源、活性氧(reactive oxygen species，ROS)是光动力的三要素。光动力是光敏剂结合特定波长光，光敏剂吸收光后与氧发生一系列反应，通过细胞毒作用或影响细胞生物行为而发挥治疗作用。有研究指出，ALA-PDT用过产生ROS可加速角质形成细胞的凋亡，同时认为NAC(ROS消除剂)作为ROS抑制剂，能有效的用于ROS的研究。
目的:本研究旨在NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞其细胞活性的影响
方法:角质形成细胞在37℃，5％CO2条件下用含10％胎牛血清的DMEM培养基进行培养。IFN-γ构建过度角化角化不全及增殖模型，将实验随机分为4组:1、IFN-γ组;2、IFN-γ+ALA-PDT组;3、IFN-γ+NAC组;4、IFN-γ+ALA-PDT+NAC。检测细胞增殖活性(CCK-8法)、细胞周期、过度角化及过度增殖相关蛋白K17及JAK通路的表达情况(WesternBlot法)。
结果:
1、NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞其细胞活性的影响
CCK8结果显示，发现IFN-γ+ALA-PDT组细胞增殖水平显著下降，差异有统计学意义。而在NAC干预后与IFN-γ+ALA-PDT组相比，增殖表达水平上升明显，差异有统计学意义。
2、NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞细胞周期表达的影响
以流式细胞仪方法检测发现IFN-γ+ALA-PDT组诱导的角质形成细胞G1期显著上升，差异有统计学意义(P＜0.05)。而在NAC干预后与IFN-γ+ALA-PDT组相比，角质形成细胞G1期显著上下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3、NAC对ALA-PDT干预后角质形成细胞JAK通路的的影响
Westernblot结果显示，与IFN-γ组相比，IFN-γ+ALA-PDT组中K17、JAK1和JAK2表达明显下降，差别有统计学意义。而NAC干预后其表达水平出现上调，差别有统计学意义。同时，与IFN-γ组相比，IFN-γ+ALA-PDT组中Socs1、Socs3表达明显上升，差别有统计学意义。而NAC干预后其表达水平出现下降，差别有统计学意义。
结论:体外实验中，5-氨基酮戊酸光动力疗法通过产生活性氧抑制IFN-γ诱导角质形成细胞过度角化及增殖，使G1期显著上升，可能与调控JAK通路和角化及增殖相关的K17有关。