论文部分内容阅读
目的本研究试图阐明核转录因子NF-KB家族成员如何与抑癌基因maspin相互作用,又如何进一步影响前列腺癌细胞的细胞生物学行为。方法采用Western blot法检测不同前列腺癌细胞株中NF-kB家族成员和抑癌基因maspin(?)勺蛋白质表达情况。通过小分子RNA干扰技术建立稳定转染RelA-siRNA、 RelB-siRNA的细胞系；转染Re1B表达质粒并建立稳定表达细胞株；设计并合成靶向maspin基因的特异性短发夹RNA(short haripin RNA, shRNA),构建靶向maspin的shRNA慢病毒表达质粒并进行细胞转染,建立稳定转染maspin-shRNA的细胞系。分别采用qRT-PCR技术和Western blot法检测前列腺细胞株转染重组质粒后RelA、 RelB、maspin mRNA和蛋白质水平的变化,并分别观察RelB或RelA沉默及过表达RelB对Maspin的影响；以及检测转染重组质粒对PC-3细胞中凋亡相关基因的影响。采用xCELLigence系统实时动态观察转染重组质粒前后细胞的生长并计算倍增时间,结合流式细胞术检测蛋白酶体抑制剂细胞毒性作用在细胞转染前后的变化。结果检测出RelA、p50、RelB和p52蛋白质在激素非依赖型前列腺癌细胞株DU145和PC-3中持续性高表达,其中以RelB在DU145细胞中表达最为显著。后在DU145细胞中敲除RelB发现其可以诱导Maspin表达上调,同时促进细胞死亡RelA沉默对Maspin蛋白质的表达无显著影响；在PC-3细胞中过表达RelB抑制了Maspin的内源性表达。成功构建靶向maspin的shRNA慢病毒表达质粒pLL3.7-siMaspin,并通过极限稀释法得到单克隆转染细胞PC-3-siMaspin。观察细胞生长,PC-3-siMaspin明显快于PC-3细胞。PC-3-siMaspin细胞的倍增时间为26.83h,而PC-3-control细胞为37.95h。PC-3-siMaspin细胞中bcl-2和A20基因1mRNA表达水平上调；而bax和bim的表达水平下调。蛋白酶体抑制剂MG-132作用PC-3-control和PC-3-siMaspin细胞8h后细胞死亡率分别为27.1%±5.6%和7.47%±2.3%,24h为24.2%±3.7%和8.2%±2.5%,36h为28.7%±3.7%和7.6±2.5%。PC-3-control细胞在MG-132作用下RelA的表达逐渐下调,而PC-3-siMaspin细胞中Re1A的表达无明显变化。结论在激素非依赖型前列腺癌细胞株中,NF-kB经典与非经典通路蛋白持续性活化。RelB负性调控了内源性Maspin的表达,进而影响了前列腺癌细胞的存活。RelA蛋白并不参与对Maspin表达的调控。在雄激素非依赖型前列腺癌细胞株PC-3中Maspin呈高表达。Maspin表达的缺失显著下调了前列腺癌细胞的倍增时间,加快了细胞的生长与增殖。Maspin表达沉默显著下调了PC-3细胞对MG-132的敏感性,并与RelA的降解的缺失相关。