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研究背景和目的脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一种常见的破坏性极大的疾病,常造成患者严重的神经功能缺陷甚至死亡,给个人、家庭及社会带来沉重的负担。脑出血后的炎症反应是导致病情进展的主要因素。在这个过程中,小胶质细胞释放的基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）、促炎细胞因子等发挥了关键作用。MMPs可以直接破坏血脑屏障（Blood brain barrier,BBB）,引起致命性脑水肿。此外,外周的炎症细胞如白细胞等可以通过受损的血脑屏障进入颅内,进一步扩大炎症损伤,致使病情恶化。因此,寻找介导小胶质细胞活化和诱导MMPs表达及促炎症因子释放的关键信号通路,将有助于发现治疗脑出血的新方法、新策略,临床和社会意义重大。近期的研究发现,心肌梗死和脑梗死可以促进细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（Extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN/CD147）的表达。部分缺血模型研究提示EMMPRIN可能诱导MMP-9的产生。但是,目前尚不清楚EMMPRIN是否参与脑出血后的神经损伤。米诺环素是一种半合成的第二代四环素,可以透过血脑屏障,在脑出血模型中具有抑制MMPs表达、减弱炎症级联反应的作用,但其相关分子机制尚不完全清楚。本研究拟探讨EMMPRIN/CD 147在脑出血病理生理过程中的作用及分子机制,并观察米诺环素是否可通过抑制EMMPRIN/CD147发挥脑出血后的神经保护作用,以期发现治疗脑出血的新靶点、新方法。方法一、EMMPRIN/CD147在小鼠脑出血后神经损伤中的作用及分子机制研究1.采用随机数字法将C57BL/6 SPF级小鼠分为假手术组（sham组）和脑出血（ICH）组,然后采用Ⅶ型胶原酶立体定位注射的方法建立小鼠脑出血模型。使用脑切片法和Fluoro Jade C染色（观察神经元变性）确认脑出血模型的有效性后,再将该组小鼠分为ICH-1d、ICH-3d及ICH-7d组。然后采用Western blot和免疫荧光染色的技术观察EMMPRIN在血肿周围的表达变化;并在相应时间点进行MMP-9、Iba1染色（小胶质细胞活化）和MPO染色（中性粒细胞浸润）。最后通过免疫荧光双标技术确定EMMPRIN的细胞来源以及与MMP-9的表达是否具有一致性。2.选用单克隆抗体anti-CD147封闭EMMPRIN信号,然后采用免疫染色和Western blot技术观察封闭EMMPRIN信号对EMMPRIN和MMP-9表达的影响,同时采用免疫组织化学的方法观察中性粒细胞的浸润情况,Fluoro Jade C染色评估神经元变性、脑组织切片计算血肿体积的变化,采用转角试验和前肢放置评估神经功能改变。二、体外研究EMMPRIN/CD147信号在小胶质细胞活化中的作用及米诺环素对其的抑制作用1.建立体外脑出血模型用凝血酶（Thromin）刺激BV2小胶质细胞,制备体外脑出血模型。细胞分为对照组和凝血酶组。对照组:不做任何处理;凝血酶组添加凝血酶（20 U/mL）孵育24小时后,通过免疫荧光Iba1染色观察小胶质细胞活化的情况,并用Western blot技术检测EMMPRIN、MMP-9和NF-κB的表达。2.敲低EMMPRIN后观察凝血酶诱导BV2细胞MMP-9和NF-κB的表达情况将细胞分为对照组:不做任何处理;siRNA阴性对照组:采用转染阴性对照序列处理细胞;和干扰EMMPRIN组（序列477、序列548、序列618）。Western blot技术检测EMMPRIN的干扰效率;同时选出转染后干扰效率最强的siRNA序列进行下一步实验,用Western blot技术观察EMMPRIN在凝血酶诱导的小胶质细胞中MMP-9和NF-κB的表达情况。3.验证NF-κB的作用将细胞分为对照组、凝血酶组和NF-κB抑制剂组,添加NF-κB抑制剂（BAY 11-7082,10 μmol/L）预处理BV2细胞60分钟,然后添加20 U/mL凝血酶孵育,24小时后用Western blot技术观察EMMPRIN、MMP-9和NF-κB的表达情况。4.验证anti-CD147抗体和米诺环素体外干预作用将细胞分为对照组、凝血酶组、anti-CD147抗体组和米诺环素组,anti-CD147抗体组和米诺环素组分别添加功能阻断性anti-CD147抗体（10 μg/mL）和米诺环素（50μg/mL）进行预处理BV-2细胞60分钟后添加20 U/ml凝血酶孵育,24小时后用Iba1进行免疫荧光染色小胶质细胞观察细胞形态,并用Western blot技术观察EMMPRIN和MMP-9表达。三、米诺环素通过调控EMMPRIN/CD147信号发挥脑出血后的神经保护作用本部分运用米诺环素干预小鼠右侧纹状体出血模型,将实验动物分成生理盐水+vehicle组、生理盐水+米诺环素组、ICH+vehicle组、ICH+米诺环素组,在治疗后3天采用免疫染色和Western blot技术观察EMMPRIN和MMP-9的表达变化,用Western blot技术,测量脑组织伊文思蓝的外渗和脑含水量观察血脑屏障的完整性,以及小胶质细胞活化、炎性细胞浸润和炎症因子释放的变化,用TUNEL染色评估细胞死亡,Fluoro Jade C染色观察神经元变性,HE染色评估脑损伤,以及进行神经功能评分。四、统计分析数据以均值±标准差表示,所有的数据分析均采用盲法。两组之间的均数比较采用t检验,多组之间均值的比较采用单因素方差分析,两两比较采用Bonferroni’s posthoc test或Dunnett’s test进行分析。P＜0.05 有统计学意义。结果一、EMMPRIN/CD147在脑出血中的作用及分子机制研究1.脑出血诱导EMMPRIN和MMP-9的表达增加（1）成功建立小鼠脑出血模型用脑切片计算脑血肿的体积,ICH组胶原酶注射1d后可见明确的血肿体积为（11.80±2.83 mm3）,第3d血肿体积（16.46±2.82 mm3）较前进一步增大,第7d血肿体积（6.16±1.02mm3）明显减小;FJC染色显示,在出血后第1d可发现大量的FJC阳性细胞,第3d FJC阳性细胞数量略有减少,第7d FJC阳性细胞数目较第3d进一步减少,但ICH-1d、ICH-3d FJC阳性细胞数目均明显多于生理盐水组（P＜0.01）。提示小鼠脑出血造模成功。（2）脑出血后血肿周围EMMPRIN表达及与MMP-9表达和神经炎症有关免疫荧光染色显示,sham组小鼠脑片仅有极少的EMMPRIN阳性细胞;ICH组在出血后1d表达明显增加,第3d EMMPRIN阳性细胞数目最多,在第7d其数目较第3d下降,前述三个时间点的EMMPRIN阳性细胞与生理盐水组相比,差异均具有统计学意义（P＜0.01）。Western blot实验结果显示脑出血可显著诱导EMMPRIN的表达,其变化趋势与免疫荧光染色结果一致。免疫组化染色实验发现,sham组小鼠脑片无明确的MMP-9阳性细胞,但在ICH-1d组脑片上可检测出大量的MMP-9阳性细胞,ICH-3d组的MMP-9阳性细胞数目进一步增加,而ICH-7d其数目有所减少,但显著高于sham组（P＜0.05）;该结果提示EMMPRIN与MMP-9的表达趋势一致。Iba1染色显示,与sham组相比,Iba1（小胶质细胞）阳性细胞反应性与MMP-9和EMMPRIN的表达相似（P＜0.01）。MPO染色显示,sham组小鼠颅内不能检测出MPO阳性细胞数目,但阳性细胞数在出血后第1d显著增加,至出血后第3d和第7d依次下降,与sham组相比显著减少（P＜0.01）。提示EMMPRIN表达水平与脑损伤的时间变化趋势是一致的。（3）EMMPRIN在脑组织中的表达分布免疫双标结果显示,在sham组EMMPRIN仅与CD31（内皮细胞）共定位;在脑出血后3d EMMPRIN与Iba1（小胶质细胞）、GFAP（星形胶质细胞）、CD31（内皮细胞）和MMP-9共定位表达,小胶质细胞共标的数目最多,提示脑出血可促使小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞上调EMMPRIN,且以小胶质细胞表达为主。免疫荧光染色显示大部分Iba1（小胶质细胞）活化细胞反应性与脑出血后MMP-9和EMMPRIN的表达相似。2.封闭EMMPRIN信号抑制MMP-9表达,减少中性粒细胞浸润和脑血肿体积,改善神经功能。采用anti-CD 147抗体干预脑出血小鼠3d后,Western blot实验证实anti-CD 147注射组的EMMPRIN及MMP-9的蛋白表达量较ICH+vehicle组明显减少（P＜0.001）;免疫荧光染色实验同时也发现ICH+anti-CD147注射组的EMMPRIN阳性细胞数明显下降,与ICH+vehicle组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）;MPO染色提示,与ICH+vehicle组相比,ICH+anti-CD147组MPO的阳性细胞数明显减少（P＜0.001）;Wstern blot结果显示,与ICH+vehicle组相比,ICH+anti-CD147组IL-1β、TNF-α表达量明显减少（P＜0.01）。FJC染色实验显示anti-CD147注射显著减少了FJC阳性细胞数目,与ICH+vehicle组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）;同时,ICH+anti-CD147组脑血肿体积（13.3 5±1.01 mm3）明显小于ICH+vehicle组（15.46±1.46 mm3）（P＜0.01）;ICH+anti-CD147 组小鼠的神经功能缺损程度明显低于ICH+vehicle组（P＜0.05）。二、EMMPRIN/CD147信号在小胶质细胞活化中的作用及米诺环素对其的抑制作用1.凝血酶激活小胶质细胞并促进EMMPRIN和MMP-9表达Iba1免疫荧光染色结果显示凝血酶组小胶质细胞胞体较对照组变大变圆,细长突起变成细小的伪足,由分枝状变成阿米巴状。凝血酶组呈现活化形态的BV2细胞数占总BV2细胞数的比值显著高于对照组（P＜0.01）。用Western blot检测结果显示,凝血酶组的BV2小胶质细胞EMMPRIN、MMP-9和NF-κB p-65核蛋白表达均较对照组显著增加（P＜0.01）。在进行RNA干扰EMMPRIN的实验中,其中siRNA-EMMPRIN-618序列转染后抑制EMMPRIN的表达效率最高（P＜0.05）。Western blot检测结果显示,与凝血酶组相比,siRNA-EMMPRIN组中EMMPRIN、MMP-9和NF-κB p65核蛋白表达量明显下降（P＜0.05）;同时凝血酶组和siRNA-NC组无显著性差异（P＞0.05）。提示EMMPRIN是MMP-9和NF-κB的上游信号。2.EMMPRIN信号通过NF-κB通路介导小胶质细胞MMP-9的表达Western blot检测结果显示,凝血酶刺激促进小胶质细胞高表达EMMPRIN、NF-κB p65核蛋白和MMP-9;加入NF-κB抑制剂后显著减少MMP-9的表达（均P＜0.05）;但不能改变EMMPRIN的表达（P＞0.05）,提示凝血酶活化的EMMPRIN信号可能通过NF-κB通路介导MMP-9的表达。3.Anti-CD147抗体或米诺环素抑制凝血酶诱导的小胶质细胞对EMMPRIN和MMP-9的表达加入anti-CD147后,小胶质细胞整体形态与对照组小胶质细胞类似;米诺环素组小胶质细胞胞体较小,四周围绕细小的突起,整体形态上与对照组和anti-CD147抗体组类似。Western blot检测结果显示,凝血酶组小胶质细胞中EMMPRIN和MMP-9表达较对照组显著增加（P＜0.05）,加入anti-CD147抗体或米诺环素均显著抑制了EMMPRIN和MMP-9表达（P＜0.05）,综上结果提示凝血酶是通过EMMPRIN信号通路激活小胶质细胞。三、米诺环素通过调控EMMPRIN/CD147信号发挥脑出血后的神经保护作用1.米诺环素减少EMMPRIN/CD147的表达用米诺环素干预脑出血小鼠3d后,采用免疫荧光和Western blot技术观察EMMPRIN的表达。生理盐水组能见少量的EMMPRIN阳性细胞数和蛋白表达,ICH+vehicle组EMMPRIN阳性细胞数和蛋白表达较生理盐水组明显增加;米诺环素注射明显减少EMMPRIN阳性细胞数和蛋白表达（P＜0.05）;同时我们发现,生理盐水组无法检测出明确的MMP-9阳性细胞和蛋白表达,ICH+vehicle组的MMP-9阳性细胞和蛋白表达明显增加;米诺环素组显著减少了MMP-9表达（P＜0.05）,提示米诺环素能减少EMMPRIN和MMP-9的表达。2.米诺环素通过降低EMMPRIN/MMP-9的表达发挥神经保护作用与生理盐水组相比,脑出血后ZO-1和occludin表达明显降低（P＜0.05）,米诺环素注射显著抑制了ZO-1和occludin的减少（P＜0.05）,但两者的整体水平仍少于生理盐水组（P＜0.05）;米诺环素治疗后出血侧伊文思蓝外渗较ICH+vehicle组明显减少（P＜0.05）,同时,米诺环素治疗组出血侧脑含水量与ICH+vehicle组相比明显减少（P＜0.05）。在生理盐水组,有罕见的小胶质细胞活化,几乎未见中性粒细胞浸润,与ICH+vehicle组相比,ICH+Minocycline组Iba1活化细胞数和MPO阳性细胞数明显减少（P＜0.01）;Western blot结果显示,与生理盐水+vehicle组比,ICH+vehicle组TNF-α和IL-1β的表达明显增高（P＜0.05）,米诺环素注射显著抑制了炎症因子的表达（P＜0.01）。TUNEL检测结果显示生理盐水组仅有少量的TUNEL阳性细胞,ICH组在血肿区域及周围可见大量的TUNEL阳性细胞。与ICH+vehicle组相比,ICH+Minocycline组TUNEL阳性细胞数显著减少（P＜0.01）。Fluoro-Jade C荧光染色结果显示,与ICH+vehicle组相比,ICH+Minocycline组FJC阳性细胞显著减少（P＜0.01）。根据血肿的体积评估脑损伤,生理盐水组损伤仅存在一个针道,与ICH+vehicle组相比,ICH+Minocycline组血肿体积减小（P＜0.01）,ICH+Minocycline组可在治疗后3天能减少神经功能缺损（P＜0.01）,提示米诺环素在急性期有神经保护作用。结论1.EMMPRIN介导小鼠脑出血后神经损伤,且与其上调MMP-9的表达有关。2.EMMPRIN通过NF-κB通路介导小胶质细胞中MMP-9的表达。3.米诺环素通过调控脑出血后EMMPRIN/CD147发挥神经保护作用。