背景和目的食管癌是世界上发病率和死亡率极高的恶性肿瘤之一。全世界每年有57万以上食管癌确诊病例,50万以上人口因食管癌失去生命。根据组织病理特征食管癌可以分为食管鳞癌和食管腺癌两大亚型,其中食管鳞癌占比约90%,受限于诊断技术和早筛指标匮乏,确诊的食管鳞癌多处于中晚期,患者的5年生存率极低（＜20%）。尽管目前基于靶向治疗和免疫治疗的肿瘤治疗方案大大改善了多种肿瘤患者的预后质量和总生存期,但是食管鳞癌的治疗仍受限于手术和放化疗。基因组和转录组学综合研究是理解肿瘤发病机制、风险因素、转移复发和药物开发等的关键。随着基因芯片技术和高通量测序技术的出现,国内外开展了一系列的基因组学研究,在基因组突变和拷贝数变化方面为我们筛选食管鳞癌的驱动基因,认识食管鳞癌发病分子机制,挖掘早筛生物标记提供了良好的研究基础。但这些研究也表明食管鳞癌的分子生物学特征具有典型的地域差异。中国的食管鳞癌集中在太行山脉,特别是河南的林州（原林县）、安阳、辉县等地,是中国也是世界上食管癌发病率和死亡率最高的地区,备受全世界食管癌研究者的关注。据我们所知,目前还没有一个针对太行山脉为主的食管癌高发区食管鳞癌基因组学研究。更为遗憾的是目前还没有结合基因组学和转录组学及系统完善的临床病理学资料对食管鳞癌进行系统研究的报道,尤其是关于食管鳞癌的基因表达和基因组不稳定性、克隆进化、免疫微环境等在大规模人群中的研究非常稀缺。目前靶向治疗和免疫治疗是肿瘤个体化诊疗的重要发展方向,全面揭示食管鳞癌基因突变图谱、基因表达谱系、分子分型和免疫微环境等生物学特征及内在关联性及与预后的关系,将十分有助于食管鳞癌筛查早期诊断、治疗选择、预后判断及寻找靶向治疗相关靶点及新药物开发。本研究收集食管癌高发区安阳地区食管鳞癌120例,期望通过全外显子测序和全转录组测序,明确食管鳞癌的基因突变图谱和构建基于基因表达的食管鳞癌分子分型,考察每个亚型的相关分子生物学特征和免疫微环境,并结合临床病理特征进行预后研究,探索食管鳞癌免疫逃逸的可能机制,为全面理解食管鳞癌的发生机制和开发新的突破性疗法提供科学依据。方法收集未经术前治疗的食管鳞癌病人手术肿瘤标本和癌旁标本,并进行生存随访和临床病理资料收集。利用全转录组测序分析食管鳞癌和对应癌旁组织的整体基因表达水平数值,挑选出表达变化差异最大的基因图谱。在此基础上进行基于基因表达的非负矩阵分解聚类,筛选出最佳的分类模式作为食管鳞癌分子分型的基础。下载TCGA RNA测序表达数据和食管鳞癌基因表达的芯片数据,验证分类模型的科学性并进行优化。对最终优化的分子分型进行组间差异基因分析和基因通路富集分析。根据和每个分型关系最密切的基因富集结果将分子分型进行命名,并分析各个亚型和生存的关系。选择生存质量最差的分型挑选代表性基因,设计PCR引物,通过RT-PCR在另外收集的食管鳞癌病人群体中验证其判定价值。利用全外显子测序分析食管鳞癌的基因突变图谱和肿瘤异质性,寻找和预后差分子分型相关的基因组变化特征。通过免疫组化技术对肿瘤切片进行CD8、CD4等免疫标记定量,对比通过基因表达特征谱的免疫细胞预测结果,确定合适的基于RNA测序预测免疫细胞类型的方法,明确食管鳞癌肿瘤免疫微环境,并将其和分子分型结果相关联进行分析,挖掘食管鳞癌预后差的分子机制。此外,通过系统分析食管鳞癌的新抗原图谱,我们研究了新抗原和食管鳞癌的预后关系,并通过HLA分型及肿瘤组织HLA等位基因杂合缺失状态（HLA LOH）鉴定和抗原递呈基因缺陷分析等探讨免疫逃逸对食管鳞癌的预后影响和有效新抗原鉴定。结果利用全转录组基因表达分析数据可将食管鳞癌分为四个亚型:以角质分化细胞皮质分化为代表特征的分化型;B细胞表面标记和T细胞趋化因子为代表特征的免疫型;类维生素A和细胞色素P450相关的药物代谢为代表特征的代谢型以及高表达WFDC2、PEG10、LGR6和SFRP1等干细胞相关标记为代表特征的干细胞型。四个分型的可靠性在三个不同平台的数据集得到了验证。四个分型和预后密切相关,干细胞型的病人总生存时间最短,该亚型相关基因高表达是生存的不利影响因素。我们在另外的65例食管鳞癌中利用RT-PCR进一步证实了干型指数越高,生存越差。利用全外显子测序我们鉴定了42个食管鳞癌相关的突变驱动基因,PIK3CA扩增和EP300基因突变与干细胞型密切相关。各个分子分型具有的独特的肿瘤突变特征,可以根据插入缺失突变特征提示肿瘤分型。我们通过肿瘤基因突变数目和突变频率定了食管鳞癌的肿瘤异质性,结果表明肿瘤异质性是影响预后生存的重要因素,四个亚型间肿瘤异质性存在显著差异,且其强度和干细胞型显著相关。免疫浸润细胞分析结果显示表达自然杀伤细胞（NK cells）标记物细胞和食管鳞癌的预后生存为负相关,并且自然杀伤细胞的标记基因CD160、XCL1和XCL2表达水平和干细胞型显著相关。基于免疫组化的空间表达定位,我们明确了XCL1和LGR6共表达在肿瘤细胞表面,而CD160则同时在肿瘤细胞和免疫细胞表达。具有NK化肿瘤细胞特征的食管鳞癌病人预后差,高表达XCL1的食管鳞癌细胞对一线化疗药物五氟尿嘧啶不敏感。我们将食管鳞癌的新抗原分为三种类型:初始新抗原、有效新抗原和表达有效新抗原,无论是哪种新抗原都显示出分子亚型间的分布统计差异,多因素生存分析表明有效新抗原和有效表达新抗原是食管鳞癌的独立预后因素。HLA LOH发生在52.43%的食管鳞癌组织中,而且56%的肿瘤组织存在至少一个抗原递呈基因缺陷。因此肿瘤细胞NK化、HLA LOH和抗原递呈缺陷是食管鳞癌免疫逃逸的主要机制,据此我们定义了食管鳞癌的免疫逃逸特征,低免疫逃逸特征的食管鳞癌预后显著好于高免疫逃逸特征患者。多维度联合预后分析结果表明,免疫逃逸和肿瘤异质性或者初始新抗原结合可以具有更显著的判定食管鳞癌预后的价值。结论本研究首次采用全转录测序构建了食管鳞癌的分子分型,食管鳞癌各亚型间存在显著预后差异。根据基因表达差异分析和基因通路分析,本研究明确了各亚型的基因表达特征,并通过全基因组突变图谱、基因突变特征分析和免疫微环境分析,探讨了食管鳞癌分子分型相关的分子机制。肿瘤细胞NK化是干细胞型食管鳞癌的重要特征,对化疗药物可能不敏感,该亚型病人可以考虑采取更积极的治疗如新抗原疫苗和靶向特定基因改变如PIK3CA和EP300等。免疫微环境和新抗原分析揭示了肿瘤细胞NK化、HLA LOH和抗原递呈基因缺陷是食管鳞癌免疫逃避的主要作用机制。本研究在多维度、不同组学层面上对食管鳞癌预后相关的分子标记进行了系统挖掘,为食管鳞癌的个体化治疗奠定了坚实的理论基础,拓宽了相关新药开发和免疫治疗的途径。