HepaRG细胞具有类似人肝祖细胞的双向分化潜能,体外可诱导分化为肝细胞样细胞及胆道样细胞。分化后的肝细胞样细胞表现出与成熟原代人肝细胞相似的特性,大量表达CYP450酶为代表的Ⅰ相代谢酶（如CYP1A2、CYP2B6、CYP2E1和CYP3A4）、Ⅱ相代谢酶、药物转运体及核受体蛋白等。HepaRG因此也被FDA、EMA以及OECD等联合推荐为较理想的ADME（Absorption,Distribution,Metabolism,and Excretion）体外研究模型。近年来,随着CRISPR/Cas9技术的发展,通过基因敲除或敲入,可大大提高体外ADME细胞模型对药物评价的灵敏性、特异性及准确性。作为国内外大量指南推荐的ADME体外细胞模型,HepaRG高效基因编辑的需求日益迫切。然而,基因编辑细胞系的构建主要基于基因编辑与单克隆培养技术结合,长期的单克隆培养及筛选在一定程度上严重影响HepaRG的分化能力,导致HepaRG的高效基因编辑仍然具有一定的挑战性。本研究应用CRISPR/Cas9结合同源重组技术对HepaRG细胞进行高效精准基因插入编辑,从细胞转染方案、sg RNA设计、重组载体设计及筛选等多角度进行系统优化,建立HepaRG高效精准编辑体系并获得精准基因敲入的细胞亚克隆。在此基础上,进一步针对所获得的基因编辑细胞亚克隆,比较不同HepaRG细胞分化方案,建立相应的高效细胞分化体系。本研究首先根据基因敲入位点CYP3A4特征,在其终止密码子附近区域设计并构建了3条特异性sg RNA,并在体外HEK293T细胞水平进行sg RNA剪切有效性分析。同时,设计并构建基因敲入的同源重组模板pc DNA3.1-T2A-Luciferase（+HAs）-Donor。将CRISPR/Cas9系统以及同源重组模板共转染HepaRG细胞,通过G418药筛以及单克隆化培养,得到单克隆细胞。最后通过PCR扩增、测序的方法进行基因敲入鉴定。结果显示,所设计构建的3条sg RNA均能有效靶向并剪切CYP3A4相应位点。经转染后单克隆细胞培养,共筛选获得149个HepaRG细胞克隆;经PCR及Sanger测序鉴定,其中6个细胞克隆发生T2A-Luciferase基因片段稳定定点敲入。为了进一步研究基因编辑HepaRG细胞的分化潜能同时优化分化方案,我们对基因敲入HepaRG-#9和野生型HepaRG分别应用三种方案进行分化（标准方案、优化方案1及优化方案2）,动态追踪比较不同分化方案中细胞表型和关键基因转录及表达的变化。结果表明:T2A-Luciferase基因敲入HepaRG-#9细胞克隆与野生型HepaRG具有相似的分化潜能,长时间单克隆培养及基因编辑操作不影响HepaRG细胞的分化潜能;当采用标准分化方案时,细胞分化至第14天时开始有肝细胞样细胞出现,第28天时肝细胞样细胞的占比约为40%;相比之下,优化方案1分化第5天即出现肝细胞样细胞,在第28天肝细胞样细胞占比高达60%,同时系列肝细胞特异性基因表达水平也显著上调。综上,本论文通过CRISPR/Cas9结合同源重组技术,成功构建T2A-Luciferase基因定点敲入入内源CYP3A4位点的荧光素酶报告细胞系HepaRG-#9;通过细胞分化方案的优化比较,建立HepaRG细胞高效诱导分化方案并对基因编辑细胞系进行成功分化,为基因编辑HepaRG细胞模型的进一步应用奠定前期基础。