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胆固醇是昆虫细胞膜结构的重要组成成分之一,同时也是甾类激素生物合成的前体物质。昆虫体内缺乏胆固醇从头合成所需的两种关键酶,故必须从食物中吸收固醇类物质以满足生长、发育和生殖的需要,因此,固醇类物质的吸收和定向转运就成为昆虫体内一个重要的生理过程。昆虫SCPx和SCP-2(SCPx-2)蛋白参与体内固醇类物质的吸收和转运。前期研究发现,斜纹夜蛾Slscpx基因在进食期中肠具有较高的表达水平,可能参与了食物中固醇类物质的吸收和转运;而在蜕皮激素(20E)合成部位前胸腺中,其表达模式与体内20E的浓度变化趋势一致,推测SlSCPx和SlSCPx-2参与了20E合成过程中甾醇底物的转运。本文为了阐述该基因在斜纹夜蛾中的调控机理和蛋白的功能,研究了该基因的表达调控机制和蛋白产物在细胞中的分布情况,获得的主要结果如下: 1.用反转录RT-PCR分析了蜕皮激素20E、保幼激素类似物methoprene、花生四烯酸和胆固醇对斜纹夜蛾Spli-221细胞中Slscpx基因表达的影响,结果发现不同浓度的化合物处理24 h后,对SlSCPx和SlSCPx-2 mRNA的表达水平均没有显著的影响。 2.在Spli-221细胞中,缺失Slscpx起始密码子上游-1214~-1243 bp之间的序列后,启动子活性下降了87.67%。凝胶阻滞实验(EMSA)结果表明,含这一序列探针可以与细胞核蛋白结合,产生两条滞后蛋白条带。对14-3-3zeta、14-3-3epsilon和Y-box蛋白的分析表明,这3个蛋白的超表达载体与连有启动子片段的报告基因载体共转染Spli-221细胞后,启动子活性没有明显变化;而EMSA实验发现,原核表达和纯化后的14-3-3zeta和14-3-3epsilon也不能与该探针结合。这说明14-3-3zeta、14-3-3epsilon或Y-box可能不直接参与Slscpx基因表达的调控。 3.生物信息学分析发现,该段启动子序列上存在SLBO(C/EBP)、Elf-1、AP-1、BRC-Z4等转录因子作用位点。细胞中分别超表达AP-1-EGFP、BRC-Z4-EGFP和Elf-1-EGFP后,对Slscpx基因启动子控制下的报告基因活性没有明显的影响,而超表达C/EBP-EGFP后,报告基因活性上升了5.57倍。另外,EMSA实验发现,纯化的C/EBP蛋白可以与该探针特异性地结合,而且C/EBP很可能是以二聚体的形式与探针结合。这些结果暗示C/EBP蛋白可能与该段启动子序列的反应元件结合,激活基因表达。 4.研究还发现,该段序列还可以与另一核蛋白结合,且该核蛋白的结合可能与TTNNAT/ATAT/AAT有关。 5.利用胶体金免疫电镜方法检查了6龄第3天斜纹夜蛾中肠细胞中SlSCPx、SlSCPx-2和SlSCPx-t蛋白的分布情况。结果发现,SlSCPx-2信号在过氧化物酶体中较为集中,其次是线粒体和内质网,其他部位分布较少;SlSCPx-t信号主要集中在过氧化物酶体中,在其他部位的分布没有明显的特异性。